逆转录病毒介导的靶向人Slingshot?1L基因的稳定转染细胞系的建立

时间: 2017-03-29 11:00:10 来源:未知 作者:admin 点击:89 次
  

                   作者:张慕蕊 王岩 赵东旭 李新娜 李群 李玉林

【摘要】  目的 应用 Slingshot(SSH)?1L重组逆转录病毒载体,建立过表达该基因的稳定转染细胞系。方法 用脂质体法将含SSH?1L的重组逆转录病毒载体pLNCX?SSH?1L转染PA317包装细胞,G418筛选,滴度测定。收集病毒上清感染MG63细胞,G418筛选。结果 应用 pLNCX?Slingshot?1L重组逆转录病毒载体,获得滴度为5×108 CFU /L的病毒上清,感染MG63细胞,获得了过表达SSH?1L基因的MG63细胞。结论 应用SSH?1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的稳定细胞系。

【关键词】  逆转录病毒;稳定转染

  【Abstract】 Objective To establish stable transfected cell line by retroviral vector encoding Slingshot?1L.Methods The plasmid pLNCX?Slingshot?1L was transfected into packaging cell PA317 by lipofectamine. The transfectants were selected by G418 and viral titers were analyzed. Virals supernatant were collected to infect MG63 sells, selected by G418. Results Virals supernatant with high viral titers were obtained by retroviral vector encoding Slingshot?1L. Virals supernatant were collected to infect MG63 sells, and the stable transfected MG63 cell line was established. Conclusions The stable transfected cell line over?expression Slingshot?1L mediated by retroviral is established successfully.

  【Key words】 Retrovirus vector; Stable transfected cell line

  细胞骨架蛋白家族成员肌动蛋白(actin)通过解聚、重聚的动态变化,在肿瘤转移中发挥重要作用。肌动蛋白解聚因子(Cofilin) 是丝切因子家族的一员,主要功能是增强actin活力,参与调控细胞的移动〔1〕。Slingshot(SSH)是一种特异的Cofilin磷酸酶,可使Cofilin去磷酸化而活化,进而抑制actin丝聚合,对细胞迁移至关重要〔2〕。目前国内外对SSH的研究才刚刚开始。本文应用SSH?1L重组逆转录病毒载体获得高滴度的病毒上清,建立过表达该基因的稳定转染细胞系,为研究肿瘤转移的相关机制奠定实验基础。

  1 材料与方法

  1.1 材料 MG63、PA317及NIH3T3细胞为本实验室保存。重组逆转录病毒载体pLNCX?SSH?1L由王岩教授惠赠(SSH?1L基因全长插入逆转录病毒载体pLNCX MCS多克隆位点,末端含有c?myc tag)。脂质体 2000购自Invitrogen公司,高糖DMEM培养基购自美国Gibco 公司,胎牛血清购自Hyclone公司,胰蛋白酶和EDTA购自Sigma 公司,免疫组织化学试剂盒购自福州迈新公司。抗人c?myc tag抗体购自博奥森生物工程有限公司,抗人P?cofilin抗体、抗人Cofilin抗体购自美国Santa Cruz公司。引物hSSH?1L前向:CACAAGCATGCAGGTGATCT,反向:TATGTGCATCCTTCCTGCTG(306 bp);GAPDH前向:GCATCCTCACCCTGAAGTAC,反向:TGGTGCCGCCAGACAGCACT(750 bp)由上海生工合成。

  1.2 病毒包装及阳性克隆筛选 将PA317细胞接种于6孔板中,至细胞长满约80%时用脂质体法将pLNCX?SSH?1L重组质粒转入PA317细胞,参考 Invitrogen公司试剂盒说明书操作。转染 48 h后以1∶8传代,然后用含 800 mg/L G418 和10%胎牛血清的H?DMEM培养基筛选。10 d后可见阳性克隆,挑选克隆,继续培养,待细胞接近完全融合时移取上清,即含有病毒的培养液。以未转染的PA317细胞作对照。

  1.3 计算病毒滴度 将NIH3T3细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板中。收集病毒液,经醋酸纤维素膜滤器过滤后,制备6个系列稀释梯度的病毒液,加入6孔板,Polybrene终浓度为8 μg/ml。病毒感染24 h后,用含500 μg/ml G418培养液筛选1 w。计算公式如下:病毒滴度=最高稀释度形成的克隆数×稀释因子。

  1.4 稳定转染细胞系的建立 将MG63细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板中,从包装细胞PA317收集的病毒液,经醋酸纤维素膜滤器过滤后,将病毒液加至MG63细胞,间隔24 h后可再次感染病毒,Polybrene的终浓度为8 μg/ml。24 h后更换含500 μg/ml G418培养液筛选,2 w后获得阳性克隆,随机挑选阳性克隆扩增培养,G418浓度降为200 μg/ml。

  1.5 稳定转染细胞系的鉴定

  1.5.1 用抗人c?myc tag抗体对转染后的细胞进行免疫荧光测定 转染和未转染的MG63细胞铺细胞爬片,待爬片上的细胞长满80%时用PBS冲洗,4%多聚甲醛室温固定30 min,PBS冲洗,加过氧化物酶阻断剂,血清封闭,加一抗(抗人c?myc tag抗体),4℃孵育过夜,PBS冲洗,加FITC标记的二抗,避光孵育,PI染核。胞浆中出现绿色荧光为阳性反应。

  1.5.2 应用RT?PCR检测SSH?1L的表达情况 提取转染和未转染MG63细胞的总RNA,测定纯度及含量,反转录合成cDNA(RT),PCR扩增,SSH?1L反应条件为94℃ 2 min,94℃ 1 min、60℃ 30 s、72℃ 30 s 33个循环,72℃ 7 min,4℃ 10 min,GAPDH反应条件为95℃ 2 min、95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s 28个循环,72℃ 10 min,4℃ 10 min,反应结束后,取PCR产物5 μl,经琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下观察,照相记录结果。

  1.5.3 Western印迹检测Cofilin和P?cofilin的表达情况 裂解细胞,离心取上清加入凝胶加样缓冲液,沸水浴上加热5 min,上样量为20 μl,电泳、转膜、杂交、ECL显色。

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