瑞舒伐他汀对乳鼠心脏成纤维细胞增殖和凋亡的影响

时间: 2017-03-31 05:00:09 来源:未知 作者:admin 点击:57 次
  

                     作者:王倩 崔炜 张海林 李亚

【摘要】    目的 研究瑞舒伐他汀(Ros)对SD乳鼠心脏成纤维细胞(CFs)增殖的抑制作用,探讨其诱导CFs凋亡的作用机制。方法 采用新生SD大鼠CFs进行体外培养,单独给予10-5,10-6,10-7,10-8mol/L Ros或与10-5mol/L焦磷酸法尼酯(FPP)联合进行干预,应用MTT比色、BrdU比色、瑞氏?吉姆萨染色倒置生物显微镜、Hochest 33258染色荧光显微镜、流式细胞分析技术等方法观察Ros对CFs增殖的抑制作用和其对CFs凋亡的诱导作用。结果 Ros不仅可明显抑制新生SD大鼠CFs增殖和DNA合成,且可诱导CFs凋亡。10-5mol/L FPP可部分逆转此作用。结论 Ros为有效的抗心脏纤维化药物,不仅可明显抑制纤维化进程,还可逆转已出现的纤维化。

【关键词】  大鼠;成纤维细胞;细胞增殖;凋亡;瑞舒伐他汀;焦磷酸法尼酯

  他汀类药物因其安全可靠的降脂作用和心血管保护作用,在临床上广为应用。然而,目前他汀类药物的应用范围主要局限于高脂血症者及冠心病患者,对于心衰患者是否应用及其利弊一直存在着争议。本文主要观察新型降脂药瑞舒伐他汀(Ros)对SD乳鼠心脏成纤维细胞(CFs)的增殖抑制作用,和对CFs凋亡的诱导作用,为他汀类药物在心衰患者应用的可行性提供参考。

  1  材料与方法

  1.1  主要仪器及试剂 

  CO2培养箱(Heal Force);生物安全柜(Heal Force);倒置生物显微镜(Olympus 1×71);相机(Canon DS126181);倒置荧光显微镜(Nikon Ellipse TE2000?S);酶标仪(Fluostar);离心机(Anke TDL?80?2C);恒温振荡器(富华SHZ?82);Ros(石药集团中奇制药技术有限公司,批号:20081201,规格:原料药);焦磷酸法尼酯(FPP)(瑞士Enzo life sciences公司);DMEM?F12培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(奥地利PAA);胰蛋白酶(美国Gibco公司);噻唑蓝(MTT)(美国Biosharp公司);二甲基亚砜(DMSO)(美国Amersco公司);溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)试剂盒(德国Roche公司);瑞氏?吉姆萨染液(珠海贝索生物技术有限公司);细胞凋亡检测试剂盒(Hochest 33258,美国Biosharp公司)。

  1.2  实验动物及CFs的培养和鉴定 

  取2~3天龄的SD大鼠(河北医科大学实验动物中心提供,许可证号:1001007)。无菌开胸,剪取心室,用D?Hanks液清洗,剪碎。0.125%胰蛋白酶+0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液反复消化,分别收集各次消化细胞悬液,加入10%胎牛血清的DMEM?F12培养基,离心,弃上清液。再加10%胎牛血清的DMEM?F12培养基,制成细胞悬液,置37℃、5% CO2培养箱内培养。根据CFs比心肌细胞贴壁速度快的特点,差速贴壁60 min,倾去上层未贴壁细胞,剩余的即为CFs,加入10%胎牛血清的DMEM?F12培养液继续培养。经倒置显微镜观察,免疫组化波形蛋白单克隆抗体阳性,鉴定为所需要的CFs,细胞纯度达98%。待CFs生长接近融合时以1∶2传代,实验用2~4代细胞。

  1.3  实验分组 

  实验共分9组,空白对照组;10-5mol/L Ros组;10-6mol/L Ros组;10-7mol/L Ros组;10-8mol/L Ros组;10-5mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组;10-6 mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组;10-7 mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组;10-8 mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组。

  1.4  MTT法测定细胞增殖 

  取对数生长期CFs 5×107/L接种于96孔板中,37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后,吸弃各孔培养基,分别加不同浓度的药物,继续培养24 h,每组设8个复孔。各组于药物刺激结束前4 h,每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl,37 ℃继续培养4 h后终止培养,吸弃上清液,每孔加入150 μl DMSO,振荡混匀,在酶标仪上选取490 nm波长测定吸光度值(A490值)。

  1.5  BrdU法测定细胞DNA合成
 
  取对数生长期CFs 5×107/L接种于96孔板中,37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后,吸弃各孔培养基,分别加不同浓度的药物,继续培养24 h,每组设8个复孔。严格按照Brdu试剂盒说明进行操作。各组于药物刺激结束前8 h,每孔加入BrdU标记液 10 μl,37 ℃继续培养8 h后终止培养,吸弃上清液,每孔加入固定液200 μl,室温孵育30 min,彻底去除固定液,每孔加入抗?BrdU?POD工作液100 μl,室温孵育90 min,弃去抗?BrdU?POD工作液,每孔用200 μl洗脱液洗涤3遍,弃去洗脱液,每孔加入显色液100 μl,室温孵育15 min,每孔加入1 mol/L H2SO4 25 μl,摇床摇1 min,在酶联免疫检测仪上430 nm处测定吸光度值(A430值) 。

  1.6  凋亡检测

  1.6.1  瑞氏?吉姆萨染色,倒置生物显微镜观察 

  取对数生长期CFs 1×108/L接种于24孔板中,37℃、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后,吸弃各孔培养基,分别加不同浓度的药物,继续培养24 h。吸弃各孔培养基,无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗1遍,滴加瑞氏?吉姆萨A溶液,使染液覆盖各孔细胞,染色1 min,将瑞氏?吉姆萨B溶液滴加于A液上面,以洗耳球轻吹液面,使两液充分混合,染色10 min,吸弃各孔染液,无菌PBS洗3遍,倒置显微镜观察,拍照。

  1.6.2  Hochest 33258染色,荧光显微镜观察 

  将无菌的盖玻片置于24孔板内,以1×108/L细胞接种,37℃、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后,吸弃各孔培养基,分别加不同浓度的药物,继续培养24 h。吸弃各孔培养基,无菌PBS洗3遍,甲醇/冰醋酸(3∶1)于4 ℃固定 10 min,无菌PBS洗3遍,每孔加Hochest 33258染液(10 mg/L)500 μl,避光染色30 min,荧光显微镜观察,拍照(激发波长340 nm,发射波长420 nm)。

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