Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统治疗人膀胱癌裸鼠移植瘤的实验研究

时间: 2017-08-29 10:00:13 来源:未知 作者:admin 点击:88 次
  

            作者:连文峰,林向阳,张素英,王春仙,杨永安,于洋,宫香宇,陈艳军,张敏

【摘要】  目的 探讨带有人端粒酶逆转录酶(Human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT)启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-tk)基因的重组腺病毒(Ad-tk)结合无毒的环氧鸟苷(gancyclovir,GCV)对人膀胱癌的治疗作用。 方法 建立人膀胱癌(人膀胱癌细胞株253J)BALB/C裸小鼠移植瘤模型 , 采用hTERT为启动子驱动Ad-HSV-TK肿瘤局部注射荷瘤小鼠后 ,腹腔注射GCV治疗并观察结果。 结果 单纯Ad-hTERT-HSV-tk和单纯GCV对肿瘤生长无抑制或促进作用;而经过Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗的裸鼠,显示出明显的肿瘤抑制作用,其体积显著低于各对照组(P<0.01),其中一裸鼠肿瘤几乎消失,其肿瘤抑制率达72.5%。 结论 异种动物移植253J细胞后,Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对体内膀胱肿瘤的生长有明显抑制作用。hTERT启动子调控腺病毒介导的HSV-tk/GCV基因系统能成功靶向性转入人膀胱癌细胞,治疗人膀胱癌效果显著,这为临床上应用自杀基因治疗晚期恶性肿瘤提供了新的思路。

【关键词】  膀胱癌;基因治疗;重组腺病毒;人端粒酶逆转录酶

     The animal research of adenoviral mediated HSV-tk/GCV suicide gene system controlled by HTERT promoter on human bladder cancer

    【Abstract】  Objective  To approach the treatment efficiency of replication defective adenovirus carrying HSV/TK gene under control of the human telomerase reverse transcriptase(hTERT) promoter and ganciclovir  (GCV) in a mouse xenografts model of bladder cancer.  Methods  We erect the model of human bladder cancer (bladder cancer cell line 253J)xenografts in BALB/C nude mouse followed by peritoneal injection of GCV.  Results  GCV and Ad-hTERTp-HSV-tk alone caused  no effect on tumor growth. Therefore Ad-hTERTp-HSV-tk /GCV system was more effectively suppressed  on tumor growth of nude mouse .The tumor volume was obviously small as compared to any control group. The tumor was disappeared in one of them. The inhibition of tumor growth reached 72.5%.  Conclusion  Ad-hTERT-TK/GCV system is highly efficacious to suppress the growth of human bladder cancer in vivo which was injected with bladder cancer cell line 253J. HSV-tk/GCV suicide gene system controlled by HTERT promoter can be selective shifted to human bladder cancer cell. And the effect is obvious, so it may be provide a new idea for treating ending malignancy in clinical use.

    【Key words】  bladder cancer;gene therapy;recombinant adenovirus;hTERT 

    HSV-tk/GCV系统是肿瘤自杀基因治疗中研究最为广泛的酶前药系统之一[1~4]。端粒酶是目前所见到的特异性较好的一种广泛的肿瘤新标志物。在90%以上的膀胱癌细胞中可检测到其活性,而在绝大多数正常细胞无活性,这源于其核心成分-人  端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的转录激活[5]。hTERT是端粒酶的催化亚单位,hTERT的启动子可用于调控治疗基因在肿瘤细胞中的靶向表达。本实验采用hTERT驱动Ad -HSV/TK基因对人膀胱癌细胞株253J进行了体内转染实验,观察对膀胱癌细胞253J的生长抑制作用,并对可能的作用机制以及影响因素进行了初步探讨。

   1  材料与方法

    1.1  材料  带有HSV-tk基因的由hTERT启动子驱动的复制缺陷型重组腺病毒 (Ad-hTERT-HSV-tk)由河北医科大学第二医院泌尿外科提供, 人膀胱癌细胞株253J由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠, BALB/C裸鼠,5~6周龄,共40只,雌性,重量18~22g。购自中国医学科学院动物培育中心。GVC购于Roche-Syntax公司 ,培养液RPMI1640(GIBCO)、含10%灭活胎牛血清(fetal bovine serum ,FBS,GIBCO)均购自美国Invitrogen公司。

    1.2  细胞培养  体外培养人膀胱癌细胞株253J,取对数生长期细胞,用0.25%的胰酶消化,离心后收集细胞。用PBS重悬,3000rpm室温下离心10min,弃上清。再用PBS重悬后离心收集细胞,调整细胞悬液,浓度为2×107细胞/ml。

    1.3  建立膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型  即将膀胱癌细胞用无菌生理盐水配成2×107细胞/ml的细胞悬液。在小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2ml细胞悬液。观察小鼠肿瘤生长情况,每周2次用圆规和游标卡尺测量肿瘤大小,2周左右,待成瘤后分组试验。肿瘤体积计算按公式:体积=长径×短径2×0.5236。

    1.4  分组及治疗方法  当肿瘤生长至体积为100mm3时,对荷瘤裸鼠进行随机分组,选用瘤体大小一致的裸鼠40只,分为10组,每组4只。A组为Ad-hTERT-HSV-tk/GCV组:于第1、5、10天每只裸鼠肿瘤内注射浓缩病毒液Ad-hTERT-HSV/tk(1×109pfu)0.1ml。第2天腹腔注射GCV100mg/(kg?d)×15d。B组为Ad-hTERT-HSV-tk组:在裸鼠瘤内注射Ad-hTERT-HSV-tk,第2天腹腔注射PBS×15d,不注射GCV。C组为GCV组:在裸鼠瘤内注射PBS,腹腔注射GCV100mg/(kg?d)×15d。D组为对照组:裸鼠瘤内每天仅注射PBS。瘤内注射Ad-hTERT-HSV-tk时,先穿刺一皮下隧道,然后针刺入肿瘤内, 留针60s。

    1.5  Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗肿瘤的疗效观察  肿瘤生长抑制的观察:自注射药物开始,每4天用圆规和游标卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤的体积,描绘肿瘤的生长曲线,共观察4周。观察期结束后采用颈椎脱臼法处死裸鼠,解剖观察瘤体的大体形态,取对照组和治疗组的肿瘤组织称重。按(1-治疗组重量/对照组重量)×100%计算肿瘤生长抑制率。 

    1.6  取膀胱肿瘤组织应用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡及免疫组化染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达  用图像分析系统测定10个×400高倍镜下记数每个视野内阳性细胞占100个肿瘤细胞的比例,取其平均值作为凋亡率。采用免疫组化染色法检测,核染色为深棕色为PCNA表达阳性细胞,×400高倍镜下记数每个视野内阳性细胞占100个肿瘤细胞的比例,连续观察10个视野,取其平均值作为PCNA增殖指数(PI)。

    1.7  统计学处理  对实验中所获得的各种数据均采用均数±标准差表示,各组数据之间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有显著性,应用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。  2  结果

    2.1  Ad-hTERT-HSV-tk/GCV对荷瘤裸鼠膀胱癌的生长抑制的观察  BALB/C裸鼠皮下接种253J细胞 2周后,可见所有的裸鼠均有肿瘤生长,成瘤率为100%,肿瘤体积为100mm3。选用瘤体大小一致的裸鼠分组实验。由图1、2可见:B、C、D各组裸鼠肿瘤生长迅速,瘤的体积差异无显著性(P>0.05),根据肿瘤的体内生长曲线,B、C、D各组的肿瘤均呈持续快速生长,生长曲线大致相同(P>0.05);而经过Ad-hTERT-tk/GCV治疗的裸鼠,显示出明显的肿瘤抑制作用,其体积显著低于各对照组(P<0.01),其中一裸鼠肿瘤几乎消失,其肿瘤抑制率达72.5%。

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