重组人白细胞介素18在原核系统中高效表达的策略

时间: 2017-08-29 19:00:13 来源:未知 作者:admin 点击:77 次
  

                作者:杨京生,田生活,全家妩

【摘要】  目的 探索并建立人白细胞介素18(hIL-18)的原核高效表达系统。方法 设计特异性引物,以RT-PCR从外周血单个核细胞中扩增出人白细胞介素18成熟肽片段,克隆进入PBV220载体。以DNAWORK软件和RNADRAW软件进行RNA结构和自由能优化;通过合成寡核苷酸和overlap PCR技术将hIL-18cDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子;酶切连接构建原核表达载体并与优化前序列比较它们在宿主菌中诱导表达结果。进而对表达条件进行了优化。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定。结果 扩增人白细胞介素18成熟肽基因序列测定正确,同时获得氨基酸密码子比例适合于大肠杆菌原核表达的突变型IL-18序列。构建的原核表达载体PBV220/mhIL-18和PBV220/ohIL-18在大肠杆菌中获得有效表达,目的蛋白的产量在相同条件下优化型比野生型序列增加达3倍,Western Blot鉴定正确。结论 根据使用的载体/宿主系统,对RNA结构和自由能优化、稀有密码子突变产生影响并能有效提高目的蛋白的表达。

【关键词】  人白细胞介素18;稀有密码子;优化密码子;overlap PCR;表达

    High expression of recombinant human IL-18 expression in pronucleus system through optimized condon

    【Abstract】  Objective  High expression of recombinant human IL-18 expression in E.coli.Methods  The yield of combinant human IL-18 expression in E.coli remains quite low because the sequence of mature hIL-18 has 37aa rare condons for E.coli in a total of 157aa. To overcome  this problem, gene synthesis was performed with optimized condons for the expression host E.coli through overlap PCR using six synthesis DNA fragments of 95-101 residues having 22-24 residues overlaps.Results  The final yield of IL-18 with optimized condons was about three times higher than the yield with the native sequence.Conclusion  The application of the above technigue may be increased the goal protein expression effectively.

    【Key words】  hIL-18;optimized condon; rare condon; overlap PCR; expression

    1995年Okamura等发现用痤疮丙酸杆菌处理的小鼠再用抗CD3单克隆抗体刺激,可释放高水平的IFN-γ。因其可诱导IFN-γ的产生,称之为γ干扰素诱生因子[1]。IGIF与IL-12在功能上有相似之处, 且在IFN-γ的诱生上两者有协同效应, 但两者的分泌途径却各不相同。基于IGIF功能上的多效性,将其命名为白细胞介素18。IL-18是18.3kD的蛋白质,它对多种细胞尤其是免疫细胞具有多向性作用,如诱导免疫细胞产生IFN-γ、增强NK细胞和CTL细胞的活性、促进IL-2介导的T细胞增殖、增强Th1单克隆和富集的多克隆T细胞产生Th1类细胞因子、促进Fas配体(FasL)在T细胞表面的表达、增强Fas介导的细胞毒作用等。IL-18的许多功能与IL-12相似,在某些方面作用甚至更强,因此被认为是一种潜力极大的增强机体抗肿瘤免疫能力、抗微生物、抗自身免疫疾病的细胞因子,目前国外已经完成其一期临床,进入二期临床研究阶段。

    IL-18是以非活性的前体形式合成,然后通过白细胞介素 1β转移酶(ICE)在天冬氨酸位点上水解, 去除含有36个氨基酸的前导序列, 成为成熟的IL-18而发挥生物学活性。成熟的人IL-18的长度分别为157个氨基酸。它们的分子中没有N-糖基化位点, 不存在二硫键,很可能巯基(-SH)就是分子的活性中心。表达产量是影响工程化生产的重要因素之一,通过反转录PCR扩增出人白细胞介素18成熟肽基因片段,将其中的原核稀有密码子突变为高频同义密码子,并进行RNA结构和自由能优化,经筛选,最后获得了高效表达的序列,表达产量在相同条件下比野生型序列增加达3倍。

    1  材料与方法[2]

    1.1  质粒和菌株  质粒PBV220、细菌DH5a,由本室保存。

    1.2  试剂  Trizol(GIBCO公司),逆转录试剂SuperscriptII(Invitrogen公司),限制性内切酶EcoRI、BamHI、PCR试剂PreMix ExTaq、PCR纯化试剂盒、T4 DNA连接酶试剂Lagation Sol I(TAKARA公司),Anti-hIL-18鼠源单抗(购自晶美公司),羊抗鼠酶标记抗体(Sigma 公司),BCA法蛋白含量检测试剂盒(PIERCE公司),其他化学试剂为分析纯。

    1.3  引物的设计和合成  用于扩增野生型IL-18的引物[3]:

    上游引物P1:5’CGGAATTCATGTACTTTGGCAAGCTTGAATC 3’(含EcoRI位点)

    下游引物P2:5’CGGGATCCTTAGTCTTCGTTTTGAACAG3’ (含BamHI位点)

    用于扩增优化型IL-18的引物:

    上游引物P3:5’CGGAATTCATGTACTTCGGTAAACTGGAATC 3’(含EcoRI位点)

    下游引物P4:5’CGGGATCCTTAGTCTTCGTTCTGAACGG3’(含BamHI位点)

    用于密码子优化的寡核苷酸链:

    寡核苷酸链O1:5’TACTTCGGTAAACTGGAATCTAAGCTGTCCGTTATCCGTAACCTGAATGAC CAGGTACTGTTTATTGATCAAGGCAACCGCCCGCTGTTCGAGGACATG  3’

    寡核苷酸链O2:5’CGAGGCTGGGAGTCTTTATACATAGAGATAATA AAGATAGTGCGTGGAGCG TTATCACGGCAGTCGCTATCGGTCATGTCCTCGAACAGCGGGC 3’

    寡核苷酸链O3:5’GTATAAAGACTCCCAGCCTCGTGGTATGGCAGTGACGATTAGCGT CAAGTGT GAAAAAATCTCTACCCTGTCCTGCGAAAACAAGATTATCAGCCTC 3’

    寡核苷酸链O4:5’CCCGGAACGGAGCGCTGGAAAAAGATGATATCAGATTTAGTGTCTTTAATGT TATCCGGCGGGTTCATCTCTTTGAAGCTGATAATCTTGTTTTCGC 3’

    寡核苷酸链O5:5’CCAGCGCTCCGTTCCGGGCCACGACAACAAAATGCAGTTCGAAAGCTC TTCCT ACGAAGGTTACTTCCTGGCGTGTGAAAAAGAACGTGATCTGTTC 3’

    寡核苷酸链O6:5’GTCTTCGTTCTGAACGGTGAACATGATAGAACGATCGCCCAGTTCGT CTTCT TTTTTCAGGATCAGTTTGAACAGATCACGTTCTTTTTCAC 3’

    引物经oligo软件验证,寡核苷酸链经DNAWORK软件(http://mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/dnaworks2.html)验证,由上海生工合成。

    1.4  野生型IL-18表达载体的构建  人外周血单个核细胞提取总RNA采用Trizol一步法,RT:42℃60min。PCR扩增采用P1P2引物,预变性94℃5min;变性94℃ 30s,退火56℃ 30s,延伸70℃ 50s;共30个循环。DNA回收按试剂盒方法进行。DNA片段经EcoRI,BamHI双酶切后插入同样双酶切的PBV220载体按连接试剂盒说明进行,称PBV220/mhIL-18。

    1.5  密码子优化  以DNAWORK软件和RNADRAW软件进行RNA结构和自由能优化;设计合成寡核苷酸将mhIL-18cDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子。采用overlap PCR技术,通过两轮PCR,第一轮采用O1-O6,95℃ 1min,65℃ 1min,72℃ 1min,共10个循环;第二轮采用P3P4,以第一轮产物为模版,95℃ 热变性7min,然后95℃1min,65℃ 1min,72℃ 1min,共40个循环,最后72℃延伸10min。同前方法插入PBV220载体,称PBV220/ohIL-18。

    1.6  重组子的挑选、酶切和测序鉴定  将连接产物转化DH5a感受态菌,以氨苄琼脂糖平板筛选,挑取克隆培养过夜,小量提取质粒进行EcoRI、BamHI双酶切鉴定。鉴定的阳性克隆送上海生工公司测序。

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