Desmin基因exon6 A360P错义突变与克山病的关系

时间: 2017-08-29 22:00:03 来源:未知 作者:admin 点击:43 次
  

                           作者:张洁 刘作功 郭雄 赖江华 

【摘要】    目的 探讨Desmin基因exon6的A360P错义突变与克山病心肌损伤发生发展的关系。方法 采用临床流行病学方法调查,随机抽取年龄、性别相匹配的慢型和潜在型克山病患者、病区正常组和非病区正常组各30例血样,提取基因组DNA,采用PCR扩增、酶切、电泳等技术比较各组Desmin基因片断酶切位点的变化。结果 慢型和潜在型克山病患者与病区正常组未检出Desmin基因exon6的A360P错义突变位点。结论 Desmin基因exon6的A360P错义突变可能不是克山病心肌损伤的易感基因突变。

【关键词】  克山病; Desmin基因;易感基因;

  克山病与扩张性心肌病(dilated?cardiomyopathy, DCM)的主要病理变化均为心肌的变性、坏死、纤维化(替代瘢痕),最终导致心脏功能失代偿 [1],两病在心肌病理学变化、临床症状体征上均缺乏特异性的鉴别诊断指标[2]。近年来已发现一些与DCM相关的基因突变,如细胞骨架蛋白基因(desmin、dystrophin、lamin A/C、δ?sarcoglycon、Metavinculin等)和心肌肌小节成分蛋白基因(Actin、a?tropomyosin、Tro?ponin T、β?MHC、Titin、cMyBP?C、MLP等)[3?4]。国内报道[5]克山病患者心肌组织中Desmin荧光染色明显异常,离病灶越近Desmin改变越明显,且与病程成正相关,以慢型克山病多见。已知desmin基因的多个突变中,exon6错义突变与DCM相关性较大,但与慢型和潜在型克山病的关系仍不明确。为此,本调查采用PCR和凝胶电泳的方法检测慢型和潜在型克山病患者中是否存在与DCM患者相同的desmin基因exon6错义突变,以寻找可能的鉴别诊断指标。

  1  材料与方法

  1.1  调查对象与分组  选取陕西省黄陵县店头镇各乡296例、非克山病病区西安市长安区 30例为调查对象,依据中国《克山病诊断标准》(标准编号:GB1702121997),检出慢型和潜在型克山病患者 82例,临床表现主要有心律失常、多发性室早、房颤等 ,其中慢型克山病患者占4.7% (14例),潜在型患者占23.0% (68例)。随机抽取克山病患者组30例(病例组),病区内正常对照组30例(内对照组)。非病区正常对照组30例(外对照组)。方差分析病例组与其他两组年龄和性别没有显著性差异。

  1.2  样品采集与处理  使用含知情同意书的统一调查表进行调查后,采集肘静脉血5mL,EDTA抗凝,冰块保存运输,置-25℃冰箱低温保存。

  1.3  实验方法

  1.3.1  外周血DNA的制备  血样采用盐析法制备DNA,用于做PCR扩增和基因突变的酶切分析。

  1.3.2  Desmin基因突变位点与引物序列选择  Desmin的基因组DNA全长11990bp,有9个外显子,其中exon6的突变类型为A360P位点错义突变,exon6上、下游引物序列来源于文献[6] ,分别为5′?CCTCTCCTGCAGAACGATTC?3′;5′?TCCTGCCTGGCCCCTCAC?3′。含exon6的片断长度为250bp,如果在基因组DNA的6211位点发生A360P错义突变,则用内切酶Bsp1286I可将该片断切开为两个分别为184bp和66bp的片断[7]。为保证实验体系及内切酶的有效性,特设定内对照。选择内切酶Bsp1286I,将desmin基因序列输入相应软件中,可看到酶切位点在5407,而5407位点位于exon4片段内,故用PCR扩增exon4片段,可被Bsp1286I切为长度分别为60bp、122bp两个片断。Exon4的引物来源于文献[7],序列为5′?AAGCCCAGTCATGCCCTACA?3′, 5′?CTTCGACTTGTACCACTCCTCAGC?3′。

  1.3.3  Desmin基因PCR扩增步骤  标准的PCR反应体系: 20μL模板DNA为200ng 基因组DNA,Tris?HCL(pH8.4) 20mmol/L、KCl 50mmol/L、MgCl2 1.5mmol/L、dNTP各50μmol/L,正反义引物各0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶2.5u 。PCR反应条件:94℃变性30s ;57℃退火30s ;72℃延伸1min;最后72℃延伸5min,循环30次。对PCR扩增的基因片断exon6及内对照 exon4选用限制性内切酶Bsp1286I进行酶切。

  1.3.4  琼脂糖凝胶电泳及银染  配制1.5g/L琼脂糖用于电泳,50V电压,电泳20-40min。

  1.3.5  分析、比较各组酶切图谱。

  2  结果

  2.1  exon4酶切位点分析  Bsp 1286I将内对照exon4片段酶切为60bp和122bp两个条带(图1)。

  2.2  克山病组、病区正常对照组和非病区对照组exon6片断酶切结果  见图2、3,各组酶切前、后均只有一条250bp条带。比较3组电泳结果,desmin基因exon6片断均未被Bsp1286I内切酶切开。

联系我们Contact

企业QQ号码:4000290153
企业QQ咨询:
全国免费电话:400-029-0153
邮箱地址: 4000290153@b.qq.com
为了确保您的论文能够顺利通过审核,
请您在与客服老师沟通时务必要总结清楚您的论文要求。

南海代写论文网