降钙素原及其在微生物检测中的应用

时间: 2017-09-07 10:00:02 来源:未知 作者:admin 点击:8 次
  

【关键词】  降钙素

    [关键词] 降钙素原;细菌感染;微生物检测

       Key words:Calcitonin zymogen; Bacterial infection; Microbe examination

    鉴别发热是由细菌感染或是由其他因素引起常较困难,因病原微生物检测时间较长(普通血培养常需时1周),而对于发热病人来说,能否尽快明确病原学诊断,合理使用抗生素是治疗的关键。近年大量研究结果显示[1,2],降钙素原(PCT)这个指标能够诊断性地区分细菌感染与病毒感染。这为微生物检测的选择提供了依据,降低了资源浪费的同时可快速明确病原学诊断,为抢救病人提供了宝贵的时间,提高了治疗效果,现综述如下。

    1  PCT的结构和来源

    PCT是降钙素(Calcltonin,CT)的前体,主要在甲状腺滤泡旁细胞内合成,是由116个氨基酸组成的糖蛋白,分子量大约13KD。它可以在酶的作用下逐步裂解成57个氨基酸的氨基PCT,32个氨基酸的CT和21个氨基酸的降钙蛋白[3]。PCT是11号染色体上降钙素I基因(CALCI)的表达产物,在不存在感染的情况下,甲状腺外CALCI表达被抑制,而主要局限于甲状腺和肺的神经内分泌细胞有一定程度的表达,在细菌感染时可诱导全身各种组织多种类型细胞CALCI表达和PCT连续性释放[4]。Oberhoffer[5]等发现,PCT在外周血单核细胞表达,其mRNA及蛋白水平均增高。在健康自愿者静脉注射一定量内毒素后连续观察,发现注射1 h后,PCT可在血浆中检出,6 h~8 h PCT迅速上升,12 h达到平台期,2 h~3 h下降至正常范围,同时发现肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素6(IL6)峰值均较PCT出现早。实验证实注射IL2,PCT显著增高,IL3则无刺激作用,细菌脂多糖及各种败血症相关因子(IL1、IL2、IL6和TNFα)对PCTmRNA表达显正刺激效应,而相应的试验条件下抗炎因子IL10对PCTmRNA的表达无作用,因此说明TNFα、IL6和细菌脂多糖可能在诱导相应细胞分泌PCT过程中起重要作用,是PCT的诱导因子,外周血单核细胞可能是败血症时PCT的来源。

    2  PCT的清除

    至今为止还未确定PCT排出的特定途径,它经肾脏排出很少,临床数据表明在严重肾功能衰竭的病例中,PCT并不大量升高。肾功能衰竭病人与健康受试者PCT浓度的降低无显著性差别,虽然尿液浓度波动范围较大,但从尿液中测出的PCT浓度与血浆中的PCT浓度比例相对恒定,约为1∶4。血浆PCT的肾脏清除率远低于1 ml/mim。因此,对有肾衰竭或接受人工肾替代治疗的病人而言,仍可用PCT来诊断是否细菌感染[6]。

    3  PCT在血浆中的稳定性

    与大多数细胞因子及降钙素不同,血浆中的PCT非常稳定。收集标本24 h后,PCT浓度在室温下大约下降12%,在4℃大约下降6%[7],因此,PCT可用常规实验室方法收集而不需特殊的储存条件,只需在分析前将样本储存于4 ℃冰箱中或冷冻,实验中应尽量避免反复冻融标本。血清和血浆均可用于PCT的测量,但为了减少误差,各医院应使用标准化的收集技术、抗凝过程和储存过程。

    4  PCT的动力学和体内半衰期

    PCT的生成非常快,内毒素刺激反应2 h~6 h之内即升高(正常人血浆中的PCT浓度<0.15 μg/ml),最初升高后,PCT值的下降取决于其在血浆中的衰减和新生成的PCT间的平衡,PCT的半衰期大约为20 h~24 h,肾功能损伤的病人中清除PCT半衰期并无显著延长。在败血症休克患者中,血浆PCT不断产生,并保持高值,已经报告在败血症休克恢复的患者中,PCT血浆浓度平均2.4 d降到初始浓度的50%,而在最终死亡的患者中PCT升高的水平持续达27 d。研究表明,若PCT的值比前1 d下降了30%以上并维持几天(至少3 d),则与脓毒血症的临床改善相关。从诱发到开始生成以及临床改善和临床值降低间的间隔来说,PCT比C反应蛋白(CRP)反应要更迅速[8]。

    5  PCT检测方法

    检测PCT可用多种方法,除过去使用费时不易自动化的凝胶层分析法和高效液相色谱分析法外,现今检测PCT较特异、敏感的方法有:双抗体夹心法、放射免疫法、免疫荧光法。双抗体夹心法运用双单克隆抗体,检测人工合成PCT,方法较特异,无交叉反应,检测最低限为10 μg/L,正常人血清中PCT浓度不能检出。放射免疫法使用由人体合成的57个氨基酸部分制成R2B7特异多克隆抗体,R2B7直接作用PCT的57个氨基酸部分,既能检测游离型PCT,又能检测结合型PCT,检测灵敏度为4 μg/L,较双抗体夹心法灵敏,但所需时间较长,且放射性元素的污染限制了此方法的应用。免疫荧光法,是一种定量的免疫荧光检测方法,两种鼠单克隆抗体与PCT抗原的两个不同的结合位点结合,一种抗体经荧光标记(示踪剂)。另一种固定在试管壁。抗体与血浆或血清中的PCT分子反应形成“夹心复合物”,荧光标记抗体被缚在试管壁上,通过发光试剂记数荧光标志物的含量,荧光信号的强度与标本PCT浓度成正比,同时测定标准品,根据已知抗原浓度的PCT制成标准曲线后,可以定量得到标本的PCT浓度。现在常用B.R.A.H.M.SPCTQ半定量快速实验。该实验应用一个单克隆鼠抗―Katacalcin(一种降钙素原降解产物)抗体结合在胶体金上(示踪物)和一个多克隆羊抗降钙素抗体(固相)。病人标本加到反应孔后,示踪物结合样品中的PCT并形成明显的抗原抗体复合物,该复合物经虹吸作用通过观察区,在这里标记的抗原抗体复合物结合到固定的抗降钙素抗体上形成夹心复合物。当PCT浓度≥0.5 μg/ml时,夹心复合物呈红色带,颜色深浅与样品中的PCT浓度成正比例,未结合的示踪物扩散到对照区,结合并产生了红色的对照带。

    6  血PCT水平测定与传统炎性参考诊断价值的比较

    6.1  WBC计数  用于诊断感染的特异性很低,不同微生物感染时白细胞计数可以升高、降低甚至缺乏。尚有许多因素能够影响WBC计数,缺乏敏感性和特异性。

    6.2  ESR  可作为许多感染和非感染疾病诊断的辅助参考指标,但无特异性,影响因素很多[9]。

    6.3  CRP是一种急性时相蛋白  多种感染及非感染因素均可引起CRP升高。炎症过程发生12 h后才能检出CRP。因此,血CRP对细菌感染诊断准确性较差[12]。在全身严重细菌感染时,血PCT增加较CRP早和快,当感染控制后回到正常范围也较CRP快;但在局部感染时PCT一般不升高,而CRP可升高。所以在没有全身感染时,CRP是一个重要的观察指标,而在全身严重感染时,PCT为一个敏感性、特异性更高的指标[10]。

    6.4  细胞因子IL6是一种前炎症细胞因子  脓毒症时,内皮细胞、单核细胞及巨噬细胞受到内毒素、TNFα、IL1刺激后分泌IL6,启动有效的炎症反应。研究表明,血IL6的水平可以诊断感染及判断预后[11]。对血PCT、IL6及炎症的其他临床指标对脓毒症诊断的准确性进行研究发现,除细胞感染外,其他非感染因素也会引起IL6的非特异性升高,因此IL6诊断脓毒症的价值受到一定的限制。另外,细胞因子如IL1、IL6、TNFα半衰期很短(几分钟至几小时),且体腔内细胞因子水平常超过血浆水平,甚至某些严重的全身细菌感染患者血浆IL6、TNFα水平反而降低,因而用目前的检测方法有时很难观察到循环中细胞因子水平的真实变化[2]。PCT的半衰期较长(约24 h),加之全身细菌感染时血浆PCT升高幅度很大(可能增加数百倍),因而与细胞因子相比,PCT是一个较理想的感染检测指标。

    6.5  补体测定  在脓毒症及SIRS时,微生物会直接或间接与补体系统发生反应,导致补体3a(C3a)升高,补体系统激活发生在脓毒症早期,常在临床症状出现前,可以作为观测脓毒症的指标。Selberg O等[12]对脓毒症病人补体进行检测,在脓毒症及严重脓毒症时血C3a水平升高,与SIRS时血C3a水平比较,两者差别有显著性(P<0.01)。独立观测指标,ROC曲线下面积分析表明,C3a为0.90,PCT为0.82,因此血C3a诊断脓毒症的价值超过血PCT。如将血PCT和C3a值合并为脓毒症评分,ROC曲线下面积达0.93,则诊断脓毒症价值更大。因此,诊断脓毒症时应用血PCT的同时参考C3a更能提高诊断的准确率。

    7  PCT的临床应用及临界值

    7.1  败血症、休克及多器官功能衰竭综合征(MODS)监测  PCT血浆浓度与细菌感染和败血症严重程度和活动程度成正比。Enquix等[13]将116例败血症患儿依年龄和疾病程度分为4组进行血清PCT检测。结果发现,预警婴儿组败血症的PCT临界浓度为6.1 ng/ml,预测有效率为93.8%;预警儿童组败血症的临界浓度8.1 ng/ml,预测有效率为100%。因此,作者认为,PCT水平8.1 ng/ml作为儿童细菌性败血症的临界浓度。日本学者Yukiok等[14]研究发现,血浆PCT水平脓毒症患者为5.4(0.9~477)ng/ml脓毒症休克患者为73.4(9.6~824.1)ng/ml。故此,现在临床多按PCT浓度>5 ng/ml为脓毒症临界浓度。

    7.2  中枢神经系统感染的鉴别  PCT对鉴别化脓性脑膜炎与病毒性脑膜炎具特异性和敏感性。Gendrel等[1]对18例细菌性脑膜炎及45例病毒性脑膜炎患者进行血浆PCT水平检测,发现细菌感染者PCT水平明显高于病毒感染者,当血PCT>5 ng/ml时诊断细菌性脑膜炎的敏感性为94%,特异性为100%。

7.3  胰腺炎的鉴别  严重胰腺炎病例中,非细菌感染或细菌感染性坏死的鉴别诊断对治疗具有深远意义。Rau等[15]把50例急性胰腺炎患者按水肿性、无菌坏死性、感染坏死性胰腺炎分成三组,检测血浆PCT浓度发现感染坏死组平均浓度明显高于无菌坏死组,水肿组最低,通过ROC曲线统计分析,预测感染性坏死胰腺炎的PCT临界值为0.8 ng/ml,以此临界值为基准预测感染性坏死性胰腺炎PCT的敏感性、特异性、准确度分别为94%、91%、92%。

    7.4  自身免疫性疾病  自身免疫性疾病患者PCT血浆浓度不升高,但并发感染的病人血浆PCT浓度明显升高。Eberhard等[16]检测了解情况53名自身免疫性疾病的病人中18名为SLE,35名为脉管炎,这些病人中99%血浆PCT值正常(0.5 ng/ml);但并发感染的11名病人,PCT值升高,为1.93[0.74~3.22]ng/ml。Schernger等[17]又对25例SLE、25例类风湿性关节炎(RA)和8例系统性抗中性粒细胞胞浆抗体相关性结节性脉管炎(AAV)患者血浆PCT检测发现,95%的SLE和RA患者血浆PCT浓度小于0.5 ng/ml,95%AAV患者血浆PCT浓度<0.89 ng/ml,故认为1 ng/ml为自身免疫性疾病患者细菌感染的临界值。

    7.5  血液透析病人  鉴定血液透析病人是否细菌感染非常重要。Schmidt等[18]检测了36例长期血液透析患者血清PCT浓度,结果发现44%患者血清PCT水平升高(0.6~1.6) ng/ml,但无临床或全身感染的体征,表明长期血液透析患者血清PCT临界值应为<1.5 ng/ml。

    7.6  肺炎  PCT值在鉴别细菌性肺炎与病毒性肺炎时不太显著。Korppi等[19]对132例肺炎患儿的研究中发现,肺炎链球菌肺炎患儿有40%血清PCT>1 ng/ml,而病毒性肺炎患儿只有12%达到这一水平(P<0.05)。若分别以血清PCT值0.5 ng/ml、1.0 ng/ml或2.0 ng/ml为鉴别细菌性肺炎和病毒性肺炎的阈值,则以0.5 ng/ml阈值的敏感性最强,为55%,以1.0 ng/ml阈值的特异性最强,为88%。

    7.7  疟疾感染  Chiwakata等[20]检测包括36例轻型疟疾、24例严重疟疾、6例致死性疟疾在内的66例疟疾感染患者血浆PCT浓度。结果发现,PCT的浓度与疟疾严重程度相关。轻型半免疫、无免疫力、严重疟疾、致死性疟疾患者PCT平均浓度分别为1.07 ng/ml、2.37 ng/ml、10.67 ng/ml和25 ng/ml。Al Nawas等[21]在研究急性疟疾血中PCT浓度时发现,证实为急性疟疾的15例患者中最高的PCT值为5.3 ng/ml,怀疑寄生虫感染未找到疟原虫患者PCT值为0.43 ng/ml。

    7.8  血液疾病和肿瘤  PCT可用于监测免疫抑制病人,监测化疗中白细胞减少的病人,在肿瘤病人中可鉴别由肿瘤分解或化疗引起的发热还是由感染所致的发热。Nevin等[22]把42例胃癌病人按感染组、非感染组分成两组,检测血浆PCT浓度发现感染组平均浓度0.79(0.52~1.06)ng/ml,明显高于非感染组平均浓度0.42(0.23~0.61)ng/ml,P<0.01,差异有显著性。说明在诊断痛症感染的PCT浓度应以>0.61 ng/ml作为临界值。

    7.9  器官移植  器官移植后,细菌、病毒、真菌感染是常见并发症,也是影响器官移植成功与否的关键因素之一。由于器官移植排斥反应的影响,使传统感染诊断出现困难。Jareova等[23]研究发现,心、肾移植患者术后2 d~3 d PCT浓度可达到7 ng/ml~10 ng/ml(正常人<0.5 ng/ml),术后合并感染的患者PCT浓度可升高到46 ng/ml~297 ng/ml;急性排斥反应或巨细胞病毒感染,患者血浆PCT浓度没有明显增高。血PCT浓度>10 ng/ml为鉴别器官移植感染较好的临界值。

    7.10  外科疾病和ICU  PCT血浆浓度术后一般不升高或轻度升高,无细菌污染或内毒素释放的轻度创伤小手术如疝手术、四肢骨科手术等后,PCT值在正常范围内;大手术如胃、食管切除术后2 d~3 d,血浆PCT可暂时升高,常不大于2 ng/ml~3 ng/ml,但有时上升到10 ng/ml;在无并发症的术后和正常伤口愈合期,第2天或第3天后迅速下降至正常值,第3天后通常不上升;在系统性炎症或败血症情况下,PCT浓度明显升高并持续性上升[24]。根据Reith等[25]研究,在术后第1天或第2天PCT值大于1.5 ng/ml,就表明有继发并发症的可能。

    7.11  儿科疾病  正常产道分娩的新生儿生后48 h内PCT有生理性波动,一般生后24 h达到高峰。鉴于这一生理性波动,Maire等[26]认为生后第1天全身严重感染的诊断临界值为1.5 ng/ml,生后第2天为10 ng/ml,此后与成人诊断临界值一致。Viallon等[27]将100%鉴别179例细菌性和病毒性脑膜炎患儿的PCT临界浓度设定为0.93 ng/ml;Hatherill等[28]则把细菌感染和疱疹病毒的PCT临界浓度设定为1.6 ng/ml,超过此浓度的患儿提示要给予相应抗生素治疗。

    7.12  腹膜炎的鉴别  腹膜是一个大器官,有非常活跃的免疫应答反应,炎症可迅速通过毛细血管扩散到各个部位,引起PCT升高。Viallon等[29]报道21例细菌性腹膜炎和40例无菌腹水的患者,进行血浆PCT、CRP、Cytokine的比较,发现血浆PCT是诊断细菌性腹膜炎最好的指标,临界值为0.75 ng/ml,敏感度95%,特异度98%。在局限性腹膜炎如急性阑尾炎、胆囊炎,PCT浓度仅中度升高或不升高。

    7.13  急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的鉴别  多种不同的病因可导致ARDS,治疗是根据病因的不同而不同。PCT可鉴别诊断ARDS的感染性和非感染性病因。根据Brunkhorst等的研究,细菌性ARDS病人PCT值大体上超过5 ng/ml,而毒素所致的ARDS其PCT浓度仅轻微升高<3 ng/ml,检验具差异有显著性,P<0.01。

    7.14  全身性炎症反应综合征(SIRS)的鉴别  Selberq等[30]检测ICU22例败血症、11例SIRS患者血浆PCT,结果发现发病8 h内,败血症患者血浆PCT平均浓度为16.8 ng/ml,明显高于SIRS患者血浆PCT平均浓度3.0 ng/ml,根据其他相关的研究,鉴别SIRS和败血症的临界值应为3.0 ng/ml较为合理。通过上面对血PCT浓度在各种疾病中变化和临界值的综述,我们可以得出如下结论:PCT在鉴别细菌感染和非细菌感染方面具有高特异性和敏感性;能诊断性的区分细菌与病毒感染;但对特殊人群或疾病患者,应建立其年龄依赖性参考值或某些慢性疾病的参考值。另外,我们可根据各种疾病PCT的临界值作为微生物检测的参考依据,提高检测准确率和缩短检测时间,避免资源浪费的同时,利于病人的治疗和康复。

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