奥曲肽对人胃癌细胞增殖的抑制作用研究

时间: 2017-10-18 21:00:09 来源:未知 作者:admin 点击:48 次
  

                    作者:杜文琪 张南征 马文青

【摘要】  目的 观察奥曲肽(octreotide, OCT)对人胃癌细胞多种生物学行为的抑制作用,并探讨部分机制。方法 MTT比色分析法测定OCT对胃癌细胞系MKN45生长的影响,流式细胞术检测细胞周期的改变,平板集落实验观察细胞集落形成能力,裸鼠移植瘤形成实验体内观察OCT对胃癌的作用,放免法观察OCT对细胞因子生长抑素(epidermal growth factor, EGF)、转化生长因子-α(transforming growth factor-alpha, TGF-α)生成的影响。结果 OCT能有效抑制MKN45细胞的增殖,呈剂量依赖性,以10-6 mol/L作用最强;OCT诱导肿瘤细胞发生G0/G1期阻滞,以OCT作用24 h时最明显;OCT可显著抑制细胞的集落形成能力,并显著抑制裸鼠移植瘤的形成。OCT作用后细胞分泌EGF、TGF-α的量均明显减少。结论 OCT在体内、体外均能有效抑制胃癌细胞MKN45的生长,可作为胃癌辅助治疗手段之一。 
【关键词】  胃肿瘤;生长抑素;细胞周期;生长抑素;转化生长因子-α
    Abstract:Objective  To investigate the effects of somatostatin analogue octreotide (OCT)on the growth of MKN45 cells and explore its possible therapeutic mechanism.Methods  The effect of OCT on cell proliferation in vitro was determined by MTT. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. Plate colony formation assay was used to examine the ability of colony formation of MKN45 cells. Tumor transplantation in nude mice was performed to observe the effect of OCT on gastric cancer in vivo. The contents of epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor-alfa (TGF-α) in culture media were measured by RIA.Results  The growth of MKN45 cells treated with OCT was obviously inhibited as compared with that of the control. The inhibitory effect of OCT occurred in a dose-dependent manner and was most potent at the concentration of 10-6mol/L. OCT arrested the cell cycle at G0/G1 phrase and reduced colony formation. The repression potential of OCT on the growth of MKN45 cells in nude mice was also noticed. The contents of EGF and TGF-α in the culture media of MKN45 cells were significantly decreased in OCT-treated subgroups as compared with those in the control.Conclusion  OCT could significantly inhibit the growth of gastric cancer cell line MKN45 in vitro and in vivo, suggesting that it may be a promising adjuvant therapy for gastric cancer.
    Key words: gastric cancer; somatostatin; cell cycle; epidermal growth factor; transforming growth factor-alpha
    奥曲肽(octreotide, OCT)是人工合成的生长抑素八肽类似物,近年来在肿瘤治疗方面的应用日益受到关注,尤其对胃肠肿瘤显示了独特的优势[1]。本研究通过探讨OCT对胃癌细胞系MKN45细胞多种生物学行为的调控作用,为其治疗胃实体瘤提供实验依据。
    1  材料和方法
    1.1  细胞、动物及试剂  人胃癌细胞株MKN45购自中国科学院上海细胞库,4~6周龄BALB/c 裸鼠购自上海肿瘤研究所。OCT(0.1 mg/支,瑞士诺华制药), RPMI 1640培养基(Gibco),胎牛血清( 杭州四季青公司),胰蛋白酶、Propidium iodide(PI)、3-(4,5-dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) (Sigma),生长抑素(EGF) RIA试剂盒(北京华英放射免疫技术研究所)、转化生长因子-α(TGF-α) RIA试剂盒(中国人民解放军总医院放免研究所)。
    1.2  细胞培养  人胃癌细胞株MKN45生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,内加青霉素100×103 U/L,链霉素100  mg/L,37℃、5%CO2浓度及饱和湿度条件下常规培养。细胞呈单层贴壁生长,每3~4天以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(1∶1)消化液消化传代。
    1.3  MTT比色分析法  对数生长期的MKN45细胞消化后调整细胞密度为1×105/ml,接种于96孔板,每孔100 μl,另加培养基100 μl。37℃、5% CO2条件下培养24 h后,更换无血清培养基继续培养24 h分组:设空白组(不加细胞)、对照组(不加药)、OCT组(分为10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L 4个浓度),每组6个复孔。继续培养72 h,每24 h更换新鲜培养基和奥曲肽。终止培养前4 h加入 MTT 40 μl/孔,避光孵育。结束培养时,吸去全部上清液,加入DMSO 200 μl/孔,微孔板震荡器震荡10 min,酶联检测仪上测定光密度(D)值(λ=550 nm)。按下列公式计算细胞抑制率:
    抑制率=[(对照组D值-空白组D值)-(实验组D值-空白组D值)]/(对照组D值-空白组D值)×100%
    1.4  平板集落形成实验  对数生长期的MKN45细胞消化后吹打成单细胞悬液。将1000个细胞接种于含液体培养基的普通平皿中(平皿直径为9 cm),分设对照组(不加药)和OCT组(培养基中加新鲜OCT,浓度为10-6 mol/L),37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞形成典型集落;以包含50个以上细胞为一个集落进行计数,普通平皿中的细胞经固定、苏木精-伊红染色、倒置显微镜下计数细胞集落。
    1.5  流式细胞技术检测细胞周期  对数生长期的MKN45细胞消化后调整细胞密度为1×105/ml,接种于50 ml培养瓶,每瓶2 ml。无血清培养基同步化24 h后分组,设0、6、12、24、36、48 h共计6个时间点,各组分别设对照组(不加药)、OCT组(OCT浓度为10-6 mol/L)。每天更换含新鲜OCT的培养基。培养结束,吸去上清,常规消化后1000 r/min离心10 min收集细胞,70%冷乙醇1 ml固定过夜。PBS洗涤后1500 r/min离心5 min去除乙醇,PI染液避光孵育30 min,上机检测。
    1.6  裸鼠成瘤实验  对数生长期的细胞消化后PBS清洗细胞3次,无血清培养液重悬,调整细胞密度为1×107/ml,裸鼠皮下注射0.1 ml 的细胞悬液。成瘤后分设对照组和OCT组(尾静脉每日注射OCT 100 mg/d),每组4只裸鼠。密切观察裸鼠的体重和全身健康状态,成瘤4周后处死裸鼠;剥离肿瘤组织并称重。
    1.7  上清液TGF-α、EGF含量测定  对数生长期的MKN45细胞消化后调整细胞悬液细胞密度为1.2×105/ml,接种于96孔板,每孔接种250 μl,37℃、5% CO2条件下培养。分组:对照组和OCT组(OCT浓度为10-6 mol/L)。分别于24、48、72 h收集培养上清液,RIA法测定TGF-α、EGF含量。操作程序按试剂盒说明书。
    1.8  统计学处理  采用SPSS 10.0软件包进行统计分析。数值均用x±s表示,均数间的比较采用t检验,P<0.05被认为有显著的统计学差异。
    2  结  果
    2.1  OCT对胃癌细胞增殖的作用  MTT法测定显示,1×10-8~1×10-6 mol/L的OCT对MKN45细胞的增殖均有抑制作用,以1×10-6 mol/L最为明显,抑制率为10.73%。各浓度组间比较亦有显著性差异。在1×10-8~1×10-6 mol/L浓度范围,OCT对MKN45细胞株的抑制作用随浓度的增高而增强(P<0.05)。与对照组相比,1×10-9 mol/L的OCT对MKN45的增殖无明显影响(P>0.05)。见表1。
    OCT作用后MKN45细胞形成集落的能力明显降低,集落数减少〔对照组为(37±4.21)个,OCT组为(24±5.13)个,P<0.05〕,且形成的集落变小。裸鼠成瘤实验检测OCT组对MKN45细胞在体内是否有抑制作用,结果显示,接种MKN45细胞4周后处死裸鼠,OCT组瘤体平均体积显著小于对照组〔对照组(18.45±3.22) mm3,OCT组(12.32±1.82) mm3,P<0.05〕,提示OCT在体内对MKN45细胞的生长亦有一定的抑制作用。表1  奥曲肽对MKN45细胞增殖的影响 与对照组比较:*P<0.05
    2.2  OCT对细胞周期的影响  流式细胞技术检测结果显示,OCT可诱导MKN45细胞阻滞于G0/G1期,并具有时间依赖性,其作用在加OCT后6 h出现,24 h最显著(P<0.05,表2)。但各时间点2组S期及亚二倍体细胞比例无显著差异。表2  奥曲肽对MKN45细胞周期的影响 与对照组比较:*P<0.05
    2.3  OCT对胃癌细胞分泌TGF-α、EGF的影响  MKN45细胞的培养上清液中TGF-α、EGF的分泌量随培养时间延长而增加。培养液中加入OCT后, TGF-α、EGF的含量较对照组相应时间点明显减少。见表3、4。 表3  奥曲肽对MKN45细胞分泌TGF-α的影响表4  奥曲肽对MKN45细胞分泌EGF的影响与对照组比较:*P<0.05,**P<0.013

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