G-CSF预处理对家兔心肌缺血/再灌注损伤的影响

时间: 2017-10-19 08:00:10 来源:未知 作者:admin 点击:28 次
  

【摘要】  目的 探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)预处理对心肌缺血/再灌注损伤的影响机制。方法 25只健康家兔,随机分为3组:假手术对照组(Sham组,n=8),生理盐水组(NS组,n=9),G-CSF组(n=8)。Sham组开胸后心肌动脉只穿线不结扎;G-CSF组于术前连续5天皮下注射G-CSF 10 μg?kg-1?d-11;NS组皮下注射生理盐水0.5 ml每日1次,连续5天;使用开胸法建立缺血/再灌注动物模型,光镜下观察各实验形态学改变,计数缺血区周边部毛细血管数量,免疫组化观察各组Bax、Bcl-2凋亡相关蛋白的表达,比较各组心肌细胞凋亡的程度。模型制备成功后,MacLab生理记录仪测定再灌注后左心室发展压(LVDP)及左心室内压最大上升和下降速率(+dp/dtmax),比较各组间心功能差异。结果 G-CSF组及NS组心功能均较Sham组下降(P?0.01),但G-CSF组心功能优于NS组(P?0.01)。G-CSF组缺血区周边部毛细血管计数高于NS组及Sham组(P?0.01)。G-CSF组Bcl-2明显高于NS组(P?0.01),Bax则明显低于NS组(P<0.01)。结论 ①G-CSF可以改善缺血/再灌注家兔的心功能;②G-CSF能够上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,同时抑制了促凋亡蛋白Bax的表达,减少了缺血急性期心肌细胞的凋亡;③G-CSF能够改善缺血心肌细胞的微循环,增加缺血区周边部毛细血管密度。 
【关键词】  缺血/再灌注损伤;心肌;粒细胞集落刺激因子;毛细血管密度
    Abstract: Objective  To investigate the mechanism of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) preconditioning on myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury. Methods  25 healthy rabbits were randomly divided into three groups: (1) sham operation group (Sham group, n=8); opening the chest, with only threading under cardiac artery and without ligation. (2) NS group (n=9), subcutaneous injection of 0.5 ml normal saline for 5 days before I/R; (3) G-CSF group (n=8): subcutaneous injection of G-CSF (10 μg ?kg-1?d-1 for 5 days before I/R). After the animal model of I/R was established for observation of morphological changes and the capillary count with light microscopy and the expression of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 with immunohistochemistry to compare the myocyte apoptosis in each group. After the animal model was prepared, the post-reperfusion LVDP and +dp/dtmax were determined by MacLab physiological recorder to compare the cardiac functional differences between each group.  Results  (1)Cardiac function in both NS group and G-CSF group was lower than that in Sham group (P<0.01), but was higher than in NS group (P<0.01). (2) The capillary count was higher in all the treatment groups with G-CSF than in NS group and the Sham group (P<0.01). (3) In the G-CSF group the expression of Bcl-2 protein was higher than that in the NS group and the Sham group(P<0.01), whereas the expression of Bax was markedly lower in G-CSF group than in the NS group(P<0.01). Conclusion  (1) G-CSF could enhance cardiac function of rabbit after I/R injury. (2) G-CSF could upregulate the expression of the anti-apoptosis protein Bcl-2 and meanwhile restrain the expression of pro-apoptosis protein Bax, and decrease the myocyte apoptosis of acute ischemia. the extent of myocardial apoptosis in ischemia and reperfusion injury. (3) G-CSF could improve the microcirculation of ischemic myocytes and increase the density of peripheral capillaries in ischemic areas.
    Key words: ischemia/reperfusion injury; myocardia; granulocyte colony-stimulating factor; density of capillary
    粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种相对分子质量约19000的糖蛋白[1],是一种调节中性粒细胞产生的多肽生长因子。G-CSF的主要作用是促进中性粒细胞的成熟并抑制中性粒细胞凋亡,是白细胞强有力的动员剂。临床主要用于急性粒细胞缺乏症,以及化疗后改善骨髓抑制。同时它还能够动员骨髓中CD34+的干细胞进入外周血。基于对干细胞治疗心肌梗死的浓厚兴趣,G-CSF、干细胞刺激因子(SCF)等造血因子治疗心肌梗死的实验及临床研究成为近年来的热点。这些研究多集中于急性心肌梗死以及梗死后的心力衰竭方面,而使用G-CSF预处理,观察G-CSF对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用鲜有报道。2006年Takahama等[2]首先研究了心肌缺血90 min,再灌注6 h,再灌注开始的时候静脉应用G-CSF 30 min,研究发现,G-CSF缩小了心肌梗死的面积,降低了室颤的发生率,同时没有改变髓过氧化物酶的活性。在该研究中,G-CSF的应用始于再灌注开始之时,此时对白细胞的动员和活化并不充分。G-CSF一方面能够明显上调中性粒细胞的数量,增强呼吸爆发及炎症细胞的趋化[3-4]。而中性粒细胞的活化又在缺血后的再灌注当中扮演了重要的角色。再灌注后的炎症反应同时也是梗死面积延展的罪魁祸首,但G-CSF另一方面表现出了抑制细胞凋亡的特性。因此使用G-CSF预处理在心肌缺血/再灌注损伤当中究竟扮演了什么样的角色是值得研究的。本文重点研究G-CSF预处理对兔心肌缺血/再灌注后心肌细胞凋亡蛋白Bax及Bcl-2的表达以及心功能的影响。
  1  材料和方法
  1.1  实验动物 
  清洁级新西兰纯种健康大耳白兔30只,体重2.3~2.7 kg,雌雄不拘,由徐州医学院实验动物中心提供。实验中5只动物死亡,完成实验的动物共25只。
  1.2  主要药品、试剂与仪器 
  重组人G-CSF(rhG-CSF,杭州九源基因工程有限公司),细胞凋亡检测试剂盒、兔抗-Bcl-2、兔抗-Bax (武汉博士德生物工程有限公司)。血细胞自动分析仪 (日本SysmaxKx-21),MacLab生理记录仪 (美国GE公司),图像分析仪 (瑞士LeicA公司)。
  1.3  实验分组及给药 
  25只健康大耳白兔,随机分为3组。①假手术对照组(Sham组,n=8),左心室支远端穿过缝线不结扎;②生理盐水组(NS组,n=9),生理盐水0.5 ml皮下注射每日1次,连续5天,第5天制备缺血/再灌注动物模型;③G-CSF组(n=8),G-CSF 10   μg?kg-1?d-1连续5天皮下注射,第5天制备动物模型。
  1.4  动物模型的制备 
  1.5%的戊巴比妥钠(30 mg?kg-1)静脉麻醉后,连接MacLab生理记录仪行心电监护及再灌注后心功能检测。 沿胸骨正中切开皮肤,暴露心脏,分离心包,暴露左心室支中下三分之一,以持针器持5-0的无创伤缝合针线绕过左心室支远端,用一内径为1.5~2.0 mm的鲁美尔管套出两端线头,收紧线头阻断左心室支远端血流,止血钳夹紧固定,观察缺血区域心肌组织颜色变淡,运动减弱,同时MacLab生理记录仪显示Ⅱ导联ST段持续抬高超过0.1 mV,30 min后松开止血钳,再灌注90 min。假手术组穿线后旷置120 min。
  1.5  血常规的检验 
  在用药之前及用药之后(制备模型之前)分别抽取耳缘静脉血2 ml置于抗凝管内送检。
  1.6  心功能的检测 
  实验动物在再灌注结束后连接压力转换器,测压管内液体加入肝素抗凝,调零,于左心室正前方心尖处垂直进针,插入左心室3~8 mm,勿太深,以防损伤心肌及心室内结构。当导管内出现血液搏动,则认为进入左心室,停止进针,打开三相开关阀门,记录左心室压力曲线、左心室发展压(LVDP)及左心室内压最大上升/下降速率(+dp/dtmax)。
  1.7  标本的取材和处理 
  心肌缺血/再灌注之后,完成心功能的测定,离断大血管,取出心脏,冰生理盐水冲洗,垂直于左心室长轴环形切取结扎线以下缺血/再灌注心肌1~3片(厚3~4 mm),并投入4%的甲醛溶液中固定。
  1.8  组织学检查 
  固定后的心肌组织经石蜡包埋、切片,脱蜡水化,苏木精-伊红染色,光镜下观察病理变化。Bax、Bcl-2的检测:从4%的甲醛溶液中取出固定好的组织块,石蜡包埋,切片,脱蜡入水。3% H2O2猝灭内源性过氧化物酶,微波加热抗原修复,滴加5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液,一抗(1∶100稀释)4℃过夜,生物素标记二抗室温30 min,DAB显色。阴性对照以PBS代替一抗。结果判断:胞质出现棕黄色颗粒者为阳性。在400倍高倍镜下用Leica Quin Standard V2.8图像分析系统进行图像分析,每张切片随机选取10个视野计算灰度值的均数及标准差。
  1.9  毛细血管密度的检测 
  组织切片在普通光镜下放大400倍,每张切片随机选取10个高倍视野,计算每个视野内直径<10 μm的毛细血管数目,计算其平均值。
  1.10  统计学处理 
  所有数据均以±s表示。采用SPSS 13.0软件进行统计分析,2组间比较用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。
  2  结  果
  2.1  一般情况 
  本实验共使用动物30只,其中2只死于气胸,3只死于麻醉意外,25只模型成功。其中17只出现不同程度的再灌注后的心律失常,主要表现为室性期前收缩、房室传导阻滞、短阵室性心动过速。
  2.2  左心室功能检测结果 
  再灌注后Sham组LVDP及±dp/dtmax均高于NS组及G-CSF组(P<0.01),G-CSF组LVDP及±dp/dtmax均高于NS组(P<0.01或<0.05)。见表1。表1  再灌注后各组左心室功能指标的比较(略)
  2.3  免疫组化检测结果 
 
  NS组和G-CSF组中Bax和Bcl-2的表达均显著高于Sham组(P<0.01);NS组Bax的表达明显高于G-CSF组(P<0.01),Bcl-2的表达则明显低于G-CSF组(P<0.01)。见表2。表2  各组心肌细胞Bax和Bcl-2的检测结果比较
(略)
  2.4  毛细血管计数 
  Sham组的毛细血管计数低于NS组及G-CSF组(P<0.01);NS组的毛细血管计数低于G-CSF组(P<0.05)。见表3。表3  各组毛细血管计数的比较(略)
  2.5  血白细胞计数 
  在使用生理盐水和G-CSF预处理前各组白细胞计数差异无显著性(P>0.05),预处理后G-CSF组白细胞计数显著高于NS组及Sham组(P<0.01)。见表4。表4  各组血白细胞计数的比较(略)
  3  讨  论
    Kajstura等[5]研究了在不同的缺血时间(从20 min到7天)凋亡和坏死对心肌梗死面积的影响,在冠脉结扎2 h的时候,以细胞凋亡为主,细胞凋亡在4.5 h的时候达到峰值水平,而在持续到1天的时候坏死水平达到峰值。由此可见心肌细胞的凋亡在缺血早期占有重要地位。
    一些研究认为Bcl-2(Bcl-XL)/Bax(Bak)的比值决定了细胞的生存或死亡[6],抗凋亡蛋白Bcl-2能够明显的改善心肌的缺血/再灌注损伤,只在心脏过表达Bcl-2的转基因鼠在再灌注模型中显示能减少46%~64%的心肌梗死面积[7]。本研究结果显示,G-CSF预处理上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制了促凋亡蛋白Bax的表达,减少了心肌细胞在缺血/再灌注中的的凋亡,改善了左心室功能;而升高的白细胞并没有影响G-CSF预处理对心肌细胞的保护作用。
    Orlic等[8]采用SCF-1及G-CSF预处理心肌梗死大鼠,发现G-CSF能够降低心肌梗死大鼠的死亡率,改善其心肌功能,以及能够促使源于骨髓的干细胞横向分化成心肌细胞。但这一观点引起争论,有学者认为骨髓的干细胞没有横向分化成心肌细胞,而是骨髓的干细胞和心肌细胞发生了细胞融合[9~11]。
    近年来的研究发现,在心脏的心肌细胞、血管内皮细胞都存在G-CSFR(G-CSF受体),并且在心肌梗死之后G-CSFR的表达上调,局部的G-CSF浓度也平行增加[12-13],这提示内源性的G-CSF在心脏保护中发挥了调节作用。G-CSF能够上调G-CSFR的表达,激活下游的Jak/Stat路径,减少急性期心肌细胞的凋亡,上调胶原酶MMP 1,明胶酶MMP 9表达,促进心肌坏死组织的瘢痕修复,改善心室重塑[14-15]。近来Harada等[16]证明了G-CSF作用于心肌细胞内的G-CSF受体激活下游Jak/Stat路径上调了抗凋亡蛋白的表达,改善了小鼠心肌梗死急性期及亚急性期的预后,G-CSF在心肌梗死急性期的抗凋亡作用改善了梗死后心肌的生存。

联系我们Contact

企业QQ号码:4000290153
企业QQ咨询:
全国免费电话:400-029-0153
邮箱地址: 4000290153@b.qq.com
为了确保您的论文能够顺利通过审核,
请您在与客服老师沟通时务必要总结清楚您的论文要求。

南海代写论文网