用改良消减法克隆类风湿性关节炎滑膜细胞中的高表达基因

时间: 2017-10-22 02:00:05 来源:未知 作者:admin 点击:58 次
                         作者:王吉村 药立波 吕厚山 刘新平 邓艳春 赵忠良 聂晓燕 孙铁铮 燕太强 

【关键词】  改良消减杂交法
  关键词: 改良消减杂交法;滑膜细胞;类风湿性关节炎 
  0 引言  
  在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)中,关节内滑膜细胞(fibroblast-like synovial cells,FLS)的过度增生是造成关节软骨破坏和关节畸形的关键环节,为了研究滑膜细胞发生增殖的机制,我们采用赵忠良等人设计的改良消减杂交法[1] ,并以骨性关节炎(osteoarthritis,OA)滑膜细胞为对照筛选RA滑膜细胞中的高表达基因.
     
  1 方法  
  将RA滑膜细胞和OA滑膜细胞分别设定为实验组和扣除组,用扣除组的cDNAs杂交扣除掉实验组中与前者相同的cDNAs,得到的就是目的产物:实验组中高拷贝数的或独有的cDNAs,也就是RA滑膜细胞中高表达的cDNAs.具体步骤为:①分别提取RA和OA FLS的mRNAs,对于实验组RA mRNAs,反转录时采用带锚定序列的反转录引物,引物序列为5’-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT(30)N-1 N-3’ ,同时在反应体系中加入根据mRNA5’GGG帽结构设计的5’锚定引物,序列为5’-AAGCAGTGGTAA-CAACGCAGAGTACGCGGG-3’,使其在反转录时在cDNA5’末端引入与3’端相同的锚定序列.对于扣除组OA mR-NAs,采用普通的反转录方法;②将扣除组OA cDNAs通过随机引物PCR扩增,掺入Biotin-dUTP,制成扣除探针;③将实验组RA cDNAs与过量OA扣除探针进行液相杂交,然后用连有链亲和素的磁珠分离杂交产物,去除杂交体和未杂交上的扣除探针;④以未杂交上的RA FLS cDNA为模板进行长距离PCR扩增,两侧引物序列均为5’-AAGCAGTG-GTAACAACGCAGAGT-3’,将扩增产物回收并克隆入质粒载体;⑤酶切质粒,将回收的酶切片段点于硝酸纤维素膜上,与扣除组cDNAs进行反向点杂交,排除假阳性克隆后,将阳性克隆测序.
     
  2 结果  
  酶切显示,在已鉴定的150个白色克隆中,55个(占36.7%)克隆的插段长度大于400bp.12个(占8%)克隆的插段长度大于1000bp.反向点杂交结果表明,55个克隆中,假阳性克隆为13个,占23.7%.对42个阳性克隆中的18个进行序列分析显示,其中12个为已知基因,占66.7%;分别为核糖体蛋白S4,S23,S25基因、干扰素诱导基因、铁蛋白轻链基因、层粘连蛋白受体基因、转化生长因子β基因、tubu-linγ-polypeptide基因、组织蛋白酶B基因、前I型胶原基因、A-raf原癌基因和IGF-1结合蛋白特异性丝氨酸蛋白酶基因,这些序列大多为已知基因的3’部分.另外,还有6个克隆为新序列,占33.3%.序列分析表明,这六个新序列均有编码区,其中4个序列各有一完整读框,分别编码85个氨基酸(amino acids,aa),45aa,139aa和45aa,另外两个序列分别为各自读框的5’部分(135aa)和3’(75aa)部分.
     
  3 讨论
     
  3.1 关于改良消减杂交法  这种方法是本室赵忠良博士等首先建立的,此方法较代表性差异分析技术和抑制消减杂交法等两种消减杂交技术有两点改进之处:一是在反转录时将实验组cDNAs的两端分别引入锚定序列,这不仅有利于杂交后差异基因的扩增和克隆,而且有利于获得全长cDNA或较长cDNA片段;二是扣除探针中掺入生物素,这样利用生物素与链亲和素结合的特性,就可以将杂交混合物中的杂交体和未杂交上的扣除组成分去掉.
    
  本研究发现,在所得到的基因片段中,8%长于1000bp,36.7%长于400bp,而且6个新序列都有编码区,反向点杂交显示,假阳性率为23.6%.所以无论从获得片段的长度上还是特异性上都明显优于差示PCR方法.另外,在测序克隆中,33.3%为新序列,在已知基因中,转化生长因子β基因和A-raf原癌基因等都是表达丰度较低的基因,提示这种方法可以克隆到低丰度的差异表达基因,在这一点上,它要优于代表性差异分析技术和抑制消减杂交法.还有,此方法的简便快捷也是显而易见的.

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