大鼠小肠移植后LFA┐1的表达和FK506的抑制作用

时间: 2017-10-23 10:00:06 来源:未知 作者:admin 点击:27 次
  

                      作者:施海 王为忠 李纪鹏 王海凤 

【关键词】  小肠/移植
    关键词: 小肠/移植;淋巴细胞功能相关抗原-1;免疫抑制;移植物排斥
     
    摘 要:目的  探讨大鼠移植小肠组织内淋巴细胞相关抗原-1(LFA-1)的异常表达与急性排斥反应之间的关系,及FK506对其的抑制作用. 方法  选用近交系封闭群SD和Wistar/A大鼠进行全小肠异位移植.实验分4组:非手术对照组(Wistar/A);同基因移植组(Wistar/A→Wistar/A);异基因移植组(SD→Wistar/A);异基因移植加用FK506治疗组[SD→Wistar/A+FK506(2mg・Kg-1 ・d-1 ,im)],每组18个样本.分别于术后3,5,7d采集移植小肠标本进行组织病理学和免疫组织化学检查. 结果  异基因移植组肠组织中LFA-1表达增高,与相应对照组比较差异显著(P<0.05);检测LFA-1可以比组织病理切片HE染色早2~3d发现排斥反应;经FK506治疗组中LFA-1表达最弱. 结论  LFA-1的表达水平和排斥反应的发生、发展有关;FK506可以明显地抑制LFA-1的表达.      
  Keywords:intestine,small/transplantation;lymphocyte function-associated antigen-1;immunosup-pression;graft rejection
     
  Abstract:AIM To assess relationship between the increased LFA-1expression in intestine graft and acute rejection,and inhibitory effects of FK506on the expression of LFA-1.METHODS Heterotopic small intestine transplantation was performed on inbred SD and Wistar/A rats.The rats were randomly divided into4groups:Control groups(Wistar/A);isograft group(Wistar/A→Wistar/A);allograft group(SD→Wistar/A);allograft plus FK506group(SD→Wistar/A+FK506),(2mg・kg-1 ・d-1 ,im).The grafts were harvest-ed at day3,5,7postoperatively immunohistochemical tech-nique was used to detect the intragraft expression of LFA-1.RESULTS Immunohistochemical staining showed the in-creased LFA-1expression in groupⅢ;which occurred2or3d earlier than that in control.Faint LFA-1expression was observed both in control group and in FK506treated group.CONCLUSION Increased LFA-1expression might be relat-ed to occurrence and development of rejection.FK506could reduce the expression of LFA-1in the grafts obviously and prolong grafts survival greatly.
     
  0 引言
     
  小肠因含有大量的淋巴组织,属于高免疫源性器官,同时又是有菌的空腔脏器,所以在临床上,小肠移植术后的排斥反应及感染的发生仍是导致移植失败的主要原因[1] .与其他实质性器官移植所不同的是,小肠移植术后无特异性血清学指标预测排斥反应.目前判断小肠移植术后排斥反应的指标仍是患者的临床症状,以及通过内镜对移植肠管的监测[2] .组织病理学的诊断尽管现在仍被认为是诊断排斥反应的“黄金标准”,但它对于排斥反应的明确诊断往往在组织损伤发生以后.本实验旨在探讨早期诊断小肠移植急性排斥反应的免疫学指标[3] .
     
  1 材料与方法
     
  1.1 实验动物和分组  随机采用清洁级、近交系封闭群大鼠,供体为SD大鼠36只,雄性,体质量(200±20)g,由第四军医大学实验动物中心提供;受体为Wistar/A大鼠108只,雄性,体质量(240±40)g,由北京医科大学实验动物中心提供.实验分4组,非手术对照组(Wistar/A);同基因移植组(Wistar/A→Wistar/A);异基因移植组(SD→Wistar/A);异基因移植加FK506(他克莫司)治疗组[SD→Wistar/A+FK506(2mg・kg-1 ・d-1 ,im)].每组18个动物,根据移植后观察时间的不同,上述4组各分为3个亚组,即3,5,7d亚组,每组为6个动物.
     
  1.2 药物及试剂  小鼠抗大鼠LFA-1mAb购自武汉博士德生物工程有限公司,FK506由第四军医大学西京医院药剂科提供.
     
  1.3 动物模型的建立和取材  实验动物术前禁食24h[4,5] .依据文献[6,7]报道,在Timmermann和Orloff术式基础上加以改良,手术要点如下:氯胺酮100mg・kg-1 ,ip,麻醉.腹中线切口,近胰腺处分离肠系膜上动脉(SMA)及门静脉(PV),然后以4℃,5×104 U・L-1 肝素钠经SMA灌洗供肠,至供肠肠管呈苍白色,经门静脉流出液为无色清亮时,将供体小肠由空肠起点至回肠末端全部取出,置于4℃的UW液内保存(UW液由我科吴国生博士赠).受体准备同供体,切除受体左肾,在左肾静脉(LRV)下方游离腹主动脉(A0 )1.5~2cm,供体SMA与受体A0 行端侧吻合,供体PV与受体LRV行套管吻合.移植小肠与受体小肠不行吻合,移植肠近端结扎旷置,远端在左侧腹壁造瘘,利于分泌肠液的排出.关腹前用37℃甲硝唑腹腔复温[8] ,术后第1日开始进食,FK506治疗组以2mg・kg-1 ・d-1 肌注给药[9,10] .分别于3,5,7d处死各亚组内动物,严格无菌条件下,采集移植小肠标本进行免疫组化及组织病理学检查. 
  1.4 组织病理学分级  依据文献[11]报道,制定排斥反应的病理学诊断标准.①轻度排斥:肠粘膜绒毛数量减少,轻度水肿,绒毛高度变矮,间质中有少量炎性细胞侵润;②中度排斥:肠粘膜绒毛数稀少,粘膜上皮开始脱落,杯状细胞和潘氏细胞数目减少,炎性细胞浸润加重,以淋巴和单核细胞为主;③重度排斥:肠粘膜绒毛结构消失,粘膜上皮完全脱落,肠壁变薄并坏死,杯状细胞和潘氏细胞消失,间质中有大量的炎性细胞浸润,基层结构破坏,血管炎性反应显著. 
  1.5 免疫组织化学检查及图像定量分析[12]   移植肠壁用恒冷的切片机(-25℃)切成厚度为6μm的切片.冰冻组织切片在磷酸盐缓冲液(PBS液)中洗涤1次,加胎牛血清37℃温育15~20min,甩干,加入1∶500稀释的小鼠抗大鼠的LFA-1αmAb,37℃温育30min,PBS液洗涤3min×3次,加入1∶200稀释的马抗小鼠IgG,室温下温育30min,PBS液洗涤3min×3次,加以PBS按1∶100稀释的链霉亲合素-生物素-过氧化酶复合物(SABC),37℃温育30min,PBS液洗涤5min×5次.然后用3,3-二氨基 联苯胺盐酸盐(DAB)显色15~20min,至低倍镜观察阳性细胞胞质显棕黄色为止.双蒸水洗涤后,苏木精复染,脱水、透明后以缓冲甘油封片.在放大400倍的光镜下观察,胞质染色显棕色的为阳性细胞,以非手术对照组中Wistar/A大鼠的小肠组织作为空白对照,同种异基因移植肠染色阳性标本作为阳性对照.随机选取10个视野,通过以下的计分系统[13,14] 计分:以10个随机视野的阳性细胞均数作为标准,计1分为无阳性细胞;计2分为阳性细胞小于均数20%;计3分为阳性细胞和均数无明显差异;计4分阳性细胞大于均数20%.阅片由同一位资深病理科医生,在未知切片所在实验分组和其他实验资料的情况下进行.
    
  统计学处理:各组移植小肠的LFA-1表达数据以x ±s表示,应用t检验及方差分析法处理,P<0.05时差异具有显著性.
     
  2 结果
     
  2.1 实验统计范围  术后48h内实验动物死亡,认为是手术失败,不在统计范围之内.
     
  2.2 移植小肠的组织病理学改变  异基因移植组大鼠分别在术后第3,5,7日发生轻、中、重度排斥反应.第1,2组无排斥反应征象,第4组在术后第5,7日部分出现轻度排斥反应.
     
  2.3 移植小肠组织的LFA┐1的表达  LFA-1阳性染色细胞主要分布在小肠的固有层,内皮细胞也有少量表达,呈弥散性分布,在小肠上皮细胞内未发现LFA-1阳性表达细胞.各实验组LFA-1表达情况如下:对照组移植肠组织LFA-1表达微弱;同种异基因移植组术后第3日,移植肠组织内LFA-1表达明显,术后第5日LFA-1继续升高,于移植术后第7日表达达到高峰,3,5,7d LFA-1的表达分别与相应的对照组比较,差异均具有显著性(P<0.05);FK506治疗组LFA-1表达微弱,与相应对照组比较差异无显著性(P>0.05).各组移植小肠组织病理学改变及LFA-1表达见Tab1.
     
  3 讨论
     
  淋巴细胞功能相关性抗原-1(LFA-1)属于整合素超家族的一类粘附分子,存在于白细胞表面,与其特异性配体ICAM-1结合后,在同种异体的器官移植排斥反应中有着非常重要的作用:①参与中性粒细胞与血管内皮粘附并穿越血管内皮过程;②参与淋巴细胞向外周淋巴器官归巢;③参与T细胞活化过程和多种细胞因子的分泌调节. 

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