反义p21WAF1/CIP1 基因转染对肾癌细胞凋亡抑制作用的影响

时间: 2017-10-24 07:00:08 来源:未知 作者:admin 点击:36 次
  

                       作者:刘贺亮 崔大祥 王禾 陈宝琦 邵国兴 严泉剑

【关键词】  肾肿瘤
    关键词: 原癌基因蛋白质p21(ras);转染;脱噬作用;肾肿瘤;肿瘤细胞,培养的
         
  摘 要:目的  探讨p21WAF1/CIP1 基因在顺铂诱导的GRC-1肾癌细胞凋亡过程中的作用. 方法  使用脂质体转染方法将正义p21WAF1/CIP1 基因及反义p21WAF1/CIP1 基因分别导入GRC-1肾癌细胞系中,对所获转染细胞进行形态学观察和流式细胞仪检测. 结果  在正义p21WAF1/CIP1 基因转染后GRC-1肾癌细胞中,顺铂诱导细胞凋亡的作用增强;在反义p21WAF1/CIP1 基因转染后GRC-1肾癌细胞中,顺铂诱导细胞凋亡的作用受到抑制. 结论  在GRC-1肾癌细胞中,顺铂诱导的细胞凋亡至少部分是通过p21WAF1/CIP1 基因发挥作用.p21WAF1/CIP1 基因作为一个与细胞凋亡的相关基因可能参与肾癌细胞凋亡的调控.
      
  Keywords:proto-oncogene protein p21(ras);transfection;apoptosis;kidney neoplasms;tumor cells,cul-tured
     
  Abstract:AIM To explore effect of p21WAF1/CIP1 gene on GRC-1renal carcinoma cell apoptosis mediated by Cisplatin.METHODS p21WAF1/CIP1 and antisense p21WAF1/CIP1 were re-spectively transfected into GRC-1renal carcinoma cell line by using lipofectin method.The observation of morphology and the detection of flow cytometer were made on transfected GRC-1cells.RESULTS Apoptosis mediated by Cisplatin were reinforced on p21WAF1/CIP1 gene transfected GRC-1cells,but were inhibited on antisense p21WAF1/CIP1 gene transfected GRC-1cells.CONCLUSION p21WAF1/CIP1gene at least part-ly produces a marked effect on apoptosis mediated by Cis-platin.p21WAF1/CIP1 ,as a gene closely related to apoptosis,might modulate the death or survivorship of renal carcinoma cell.
     
  0 引言
     
  近年来研究1-5] 发现抑癌基因p21WAF1/CIP1 作为一种细胞周期负性调控因子,参与了细胞凋亡的活动,体外转染p21WAF1/CIP1 基因可以抑制多种肿瘤细胞的生长.同时,相关研究[5-7] 还表明p21WAF1/CIP1 基因在肿瘤的发病机制中可能起着重要的作用.因此,在肾癌细胞中研究p21WAF1/CIP1 基因的作用很有必要.我们将正义p21WAF1/CIP1 基因及反义p21WAF1/CIP1 基因分别转染至GRC-1肾癌细胞后,用顺铂诱导建立肾癌细胞凋亡模型,通过对这两种凋亡模型和原代细胞凋亡模型进行比较,探讨p21WAF1/CIP1 基因在肾癌细胞凋亡过程中的作用.
     
  1 材料和方法
     
  1.1 材料  WAF1全长cDNA2100bp连接于PCEP4逆转录病毒表达载体NotⅠ与HindⅢ位点之间(由EL-Deiny等构建,第四军医大学基因所崔大祥博士惠赠).GRC-1肾癌细胞由北京医科大学泌尿外科研究所提供,常规培养于含100mL・L-1 灭活小牛血清的1640培养液.p21mAb(中山公司).流式细胞仪、透射电镜由第四军医大学中心实验室提供. 
  1.2 方法
     
  1.2.1 反义p21WAF1/CIP1 质粒的构建和提取  PCEP4-p21WAF1/CIP1 质粒经NotⅠ,HindⅢ双酶切反应后回收PCEP4和WAF1两个片段,加入T4连接酶缓冲液、ATP,T4DNA连接酶,15℃过夜.将重新连接的质粒DNA行大肠杆菌XL1-Blue转化实验,随机挑选数个单菌落,扩增,提取质粒DNA,质粒DNA纯化后,行XhoⅠ+EcoRⅠ酶切反应,10g・L-1 琼脂糖凝胶电泳,根据片段大小挑选出PCEP-WAF1-antisense质粒.
     
  1.2.2 基因转染  使用脂质体Lipofectamin TM reagent(Gibco),按操作说明书将PCEP-WAF1和PCEP-WAF1-antisense分别转染至GRC-1肾癌细胞.转染后细胞在含有G418(500mg・L-1 )和潮霉素(250mg・L-1 )的RPMI1640培养液中筛选后继续传代培养至第10代.将原代细胞及转染后筛选、培养的第10代细胞加入20μmol・L-1 顺铂,分别建立凋亡模型.
     
  1.2.3 p21蛋白表达检测  收集各组转染基因后肾癌细胞及原代细胞,用免疫荧光方法按文献[8]操作对细胞进行FITC标记,流式细胞仪分析定量分析p21蛋白表达FITC荧光强度.
     
  1.2.4 形态学观察  ①光镜观察:取出培养瓶中带有各组GRC-1肾癌细胞的盖玻片,950mL・L-1 乙醇固定30min,晾干,常规HE染色,显微镜下观察.②透射电镜观察:收集冲洗细胞,1000r・min-1 离心5min,沿管壁缓慢加入30g・L-1 戊二醛固定,四氧化锇后固定,常规电镜脱水,包埋,超薄切片,染色,电镜观察.
    
  1.2.5 流式细胞仪检测  收集各组转染基因后第10代细胞及原代细胞,分别予以10μmol・L-1 ,20μmol・L-1 和40μmol・L-1 处理,使用流式细胞仪进行分析.
    
  统计学处理:实验结果使用χ2 检验.
     
  2 结果
     
  2.1 顺铂诱导原代细胞凋亡  原代细胞顺铂作用1h后,在浓度大于20μmol・L-1 各组细胞均可见部分细胞逐渐分离,细胞变小,细胞离壁上浮,并随时间延长、顺铂浓度升高而增多.12h后,在20μmol・L-1 和40μmol・L-1 组原代细胞HE染色均可见细胞边集,核膜皱缩现象.透射电镜观察可见肾癌细胞体积明显缩小,胞内结构密度增加,聚集成块的染色质在核膜下边集,并见凋亡小体.
     
  2.2 p21基因转染对细胞凋亡的影响  转染正义p21WAF1/CIP1 基因后未经任何处理的细胞早期有脱壁现象,电镜可观察到有凋亡小体出现,将第10代细胞加入20μmol・L-1 顺铂处理后,细胞早期同样出现脱壁现象,透射电镜观察可见凋亡小体.转染反义p21WAF1/CIP1 基因后未经任何处理的细胞早期无细胞 凋亡现象出现,第10代细胞加入40μmol・L-1 顺铂处理后,细胞才出现脱壁现象,使用透射电镜可观察到少量凋亡小体(Fig1).
     
  2.3 p21蛋白表达检测  流式细胞仪检测肾癌细胞FITC荧光强度的结果显示转染正义p21WAF1/CIP1 基因的肾癌细胞FITC染色率为90.6%,转染反义p21WAF1/CIP1 基因的肾癌细胞FITC染色率为1.4%,原代细胞FITC染色率为21.6%,三者之间存在显著性差异(P<0.01).
     
  图1 电镜下观察转染反义p21 略
          
  2.4 流式细胞仪检测结果  顺铂诱导原代细胞凋亡时,在20和40μmol・L-1 组均发生凋亡改变,流式细胞仪均显示有凋亡峰,在20μmol・L-1 浓度时,凋亡细胞占细胞总数的29.4%.转染正义p21WAF1/CIP1 基因的第10代细胞加入20μmol・L-1 顺铂处理后,凋亡细胞占细胞总数的75.6%.转染反义p21WAF1/CIP1 基因的第10代肾癌细胞仅在加入40μmol・L-1 顺铂处理后,流式细胞仪才显示有凋亡峰存在,此时凋亡细胞占细胞总数的15.1%.经χ2 检验分析表明,在使用20μmol・L-1 顺铂诱导凋亡后,原代细胞与两种转染基因细胞的凋亡细胞率间的差异有显著性(P<0.01).

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