B超在测定不同方法消毒的骨形成蛋白成骨诱导活性中的意义

时间: 2017-10-24 08:00:02 来源:未知 作者:admin 点击:23 次
  

                    作者:赵廷宝 范清宇 张殿忠 文艳华 何一成 


【关键词】  超声检查,
    关键词: 骨形态,发生蛋白质类;骨生成;超声检查 
    摘 要:目的  探讨B超在测定骨形成蛋白(bone morpho-genetic protein,BMP)成骨诱导活性的意义,为BMP成骨诱导活性的测定提供一种新方法. 方法  将自行提取的牛BMP(bBMP)分别经环氧乙烷熏蒸消毒和10000Gyγ-射线照射消毒后埋入小鼠右、左后腿肌袋内,于术后3,5,7,14,21和28d行B超、X射线照相和组织形态学观察. 结果  B超3,5和7d与对照组相同,均为正常组织回声,14,21和28d有软骨和骨组织回声,在此时间段内随时间延长回声增强.X射线照相3,5,7和14d无骨组织影像,21,28d有明显的新生骨征象.组织形态学观察3,5,7d有大量间充质细胞在BMP植入部位聚集,并诱导间充质细胞分化为成软骨细胞,14d有新生软骨和新生骨组织形成,21,28d可见大量的新生的成熟骨组织.环氧乙烷熏蒸和10000Gyγ-射线照射消毒的bBMP均有很强的成骨诱导活性. 结论  B超、X射线照相和组织形态学观察结果在时间上有很强的一致性,证明B超作为一种新的BMP成骨诱导活性的检测手段是切实可行的.γ-射线照射消毒BMP更方便、更安全.
      
  Keywords:bone morphogenetic proteins;osteogenesis;vl-trasonogrophy
     
  Abstract:AIM In order to investigate the significance of B-mode ultrasound for determination of bone induction activity of bone morphogenitic protein(BMP)and to search for a new method to determinate the activity.METHODS Self-pre-pared bovine bone morphogenetic protein(bBMP)sterilized by enthlene oxide andγ-ray with same weight was buried in the muscles of the behind right and left leg of the mouse re-spectively.The place which bBMP was buried in was exam-ined with B-mode ultrasound,X-ray and histologically at3,5,7,14,21and28days after the operation respectively.RESULTS No new bone was found by B-mode ultrasound and X-ray at3,5,7,14days and the new bone was found at21,28days.A large number of mesenchymal cells were found histologically in the muscles in which bBMP was buried at3,5,7days.The new cartilage and the new bone was found at14day and the new bone which was like the normal bone was found at21,28days.It seems that there was no difference of the bone induction activity between bBMP steril-ized by enthlene oxide andγ-ray.CONCLUSIONS The de-terminative results of B-mode ultrasound,X-ray and histo-logical section were identical with time.So it seems feasible that B-mode ultrasound is regarded as a new method to deter-mine the bone induction ability of bBMP.It is safer and more convenient for bBMP sterilized byγ-ray.
     
  0 引言
     
  国内已有多家单位掌握了骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)的提取技术,这使BMP的广泛研究和应用成为可能.但是BMP提取工序繁杂,生产条件限制颇多,所得到的BMP不是每批次都有成骨诱导活性,故供研究或应用前均须行生物学活性测定.目前常用的测定方法是X射线照相和组织形态学观察.我们根据B型超声的工作原理,试行将其引入到BMP成骨诱导活性的测定,得到了令人满意的结果,从而为BMP的研究和应用提供了一种新的活性测定方法,丰富了其检测手段.
     
  1 材料和方法
     
  1.1 材料  取健康雄性小鼠24只(第四军医大学动物中心提供),体质量25~30g. 
  1.2 方法
     
  1.2.1 bBMP的提取与消毒保存  按金岩等[1] 介绍的改良Urist等[2] 方法,取新鲜牛四肢长骨的皮质骨,粉碎成直径1mm的骨颗粒,依次经1 1甲醇/氯仿、0.6mol L-1 盐酸、2mol L-1 氯化钙、0.5mol L -1 乙二胺四乙酸二钠、8mol L-1 氯化锂、6mol L-1 尿素+0.5mol L-1 氯化钙+10mmol N-乙基马来酰亚胺透析、离心,4mol L-1 盐酸胍+0.05mol L-1 氯化钙、0.25mol L-1 柠檬酸缓冲液透析、离心等处理后,得到成骨诱导活性较高的粗提bBMP,分别用环氧乙烷和60 Coγ-射线10000Gy照射消毒,置-80℃冰箱保存备用.
     
  1.2.2 bBMP成骨诱导活性的测定  随机将小鼠分为实验组18只和对照组6只.实验组于每只小鼠(行戊巴比妥钠10mL kg-1 ,ip麻醉)两侧后腿股部埋入等量的(5mg)bBMP,右侧为环氧乙烷消毒者,左侧为γ-射线消毒者.对照组做空白对照.
    
  分别于术后3,5,7,14,21和28d行B超、X射线照相和组织形态学观察.B超:致死量麻醉下(行戊巴比妥钠50mL kg-1 ,ip,下同),将小鼠四肢伸展,仰卧位固定于泡沫板上,在bBMP植入部位行B超检查,随后取材.X射线照相:麻醉同上,俯卧位,四肢自然伸展摄X线片,随后取材.组织形态学观察:致死量麻醉后随即取材.对照组:致死量麻醉下,先行B超检查,再行X射线照相并取材.以上取材后的组织,经戊二醛固定24~48h,盐酸脱钙24h后碳酸锂中和,经梯度乙醇脱水,石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察.
     
  2 结果
     
  2.1 B超  对照组均为正常组织回声.实验组3,5和7d的B超回声与对照组相同.14d,在bBMP植入部位产生弱的回声,21和28d回声增强(Fig1).在此时间段内,回声随时间延长而增强.经计算机图像分析,左右两侧的回声无差别.
     
  2.2 X射线照相  对照组均为正常组织影像,实验组3,5,7和14d的X线表现与对照组相同,21和28d出现新生骨组织影像(Fig2).在此时间段内,X线片上的新生骨密度随时间延长而逐渐增加.经计算机图像分析,左右两侧的X线表现无差别.
     
  2.3 组织形态学观察  对照组为正常的肌肉组织.实验组3,5和7d,bBMP植入部位的肌肉内有大量的间充质细胞聚集,其中7d时间充质细胞被诱导分化为软骨细胞(Fig3).14d有大量的新生软骨及少 量的骨组织并可见骨小梁.21及28d新生骨组织明显增多,骨小梁丰富,有骨髓和骨髓腔形成并可见哈佛系统(Fig4).
     
  3 讨论
     
  3.1 BMP成骨诱导活性测定的必要性  对肿瘤性骨缺损进行修复是骨科临床一个不容回避的问题,为此范清宇等[3,4] 独创性的应用异体脱钙骨基质颗粒复合骨水泥进行了有益的尝试并获得了令人瞩目的临床结果,该材料具有极好的可塑型性[5] ,适宜于修复各个部位的骨缺损,复合BMP后可具有成骨诱导活性[6,7] ,有很好的应用前景.为进一步研究和开发应用,我们开展了提取BMP的工作,但是,BMP提取工艺繁杂,生产条件限制多,最后所得到的BMP不一定都有成骨诱导活性,因此,在提取后供给研究或临床应用之前必须进行成骨诱导活性的测定.为保证所得到的BMP具有活性,在提取过程中应注意以下几个问题[1] :①用于提取BMP的新鲜骨质在获得后应及时对其处理,并马上用于BMP的提取,或保存于-40℃以下的冰箱内,否则将大大影响BMP提取的产量和活性.②虽然BMP可耐受较高的温度(55℃~75℃不致失活),但提取过程中长时间在0℃~30℃温度下搁置,可使BMP因自溶而损耗.③很好的冻干可以明显地保存BMP的活性,并不受保存时间长短的影响,但反复冻溶以及在液态下保存可影响其活性.④BMP对一些外源性酶如胰蛋白酶和糜蛋白酶敏感.⑤对碱敏感,pH值超过8.5即可使其失去活性.⑥机体组织中,特别是骨组织中含有一种BMP降解酶(BMP-ase),对释放及扩散出来的BMP有降解作用,因此,在提取过程中要加入BMP-ase的抑制剂,即N-乙基马来酰亚胺.

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